翻譯關於nature上發表的一篇奠基性的文章：
03212013 Nature Article
Title：Circular RNAs are alarge class of animal RNAs with regulatory potency
文章題目：環狀RNA是一大類具有調節功能的動物RNA
Abstract Circular RNAs（circRNAs）inanamals are an enigmatic class of RNA with unknown function. To explorecircRNAs systematically, we sequenced and computationally analysed human, mouseand nematode RNA. We detected thousands of well-expressed, stable circRNAs,often showing tissue/developmental-stage-specific expression. Sequence analysisindicate important regulatory functions for circRNAs. We found that a humancircRNA, antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript(CDR1as), is densely bound by microRNA(miRNA) effector complexes and harbours63 conserved binding sites for the ancient miRNA miR-7. Further analysesindicated that CDR1as functions to bind miR-7 in neuronal tissues. Human CDR1asexpression in zebrafish impaired midbrain development, similar to knocking downmiR-7, suggesting that CDR1as is a miRNA antagonist with a miRNA-binding capacityten times higher than any other known transcript. Together, our data provideevidence that circRNAs form a large class of post-transcriptional regulators.Numerous circRNAs form by head-to-tail splicing of exons, suggesting previouslyunrecognized regulatory potential of coding sequences.
摘要
動物體內的環狀RNA（circRNA）是謎一樣具有未知功能的RNA。為系統研究環狀RNA，我們對人，小鼠以及線蟲的RNA進行了序列測定和計算機分析。我們檢測到了成千種表達很好的穩定的環狀RNA，它們通常具有組織或發育階段的特異性表達。序列分析說明環狀RNA具有重要的調控作用。我們發現，一種人類的環狀RNA，與小腦變性相關蛋白-1的轉錄物（CDR1as）呈反義，被大量微RNA（miRNA）效應因子複合物結合，它含有67個可以與古老的微RNAmiR-7結合的位點。進一步的分析指出，CDR1as在神經組織中與miR-7結合。在斑馬魚中表達人的CDR1as會破壞中腦的發育，與miR-7的缺失相似，說明CDR1as是一種miRNA的拮抗劑，其結合miRNA的能力比其他已知的轉錄物高10倍。綜上，我們的數據提供了證據證明環狀RNA形成了具有轉錄後調節功能的一大類物質。大量的環狀RNA由外顯子頭對尾剪接形成，說明以前沒有認識到編碼序列具有調節功能。
（介紹部分）
成熟信使RNA是帶有5』和3』末端的線性分子，兩端反映在DNA模板上RNA聚合酶的起始和終止。在細胞中，有時不同的RNA分子通過剪接反應（反式剪接）結合在一起，但是單個RNA分子兩個末端通過共價結合形成一個環狀RNA是很罕見的。在植物中發現的環狀RNA是編碼亞病毒感染因子的。在單細胞生物體中，環狀RNA往往出自核糖體前體RNA內含子的自我剪接，但也可以在古細菌中通過編碼蛋白的基因產生。在不多見的已清楚驗證過的動物環狀RNA形成中，剪接體似乎在同一個轉錄物上將外顯子5』端與下遊3』端連接到一起。也許已知最清楚的環狀RNA是從SRY位點（sex-determiningregion Y）轉錄的mRNA的反義序列，這個環狀RNA在睪丸中大量表達。在古細菌和哺乳動物的表達數據的計算機分析結果說明環狀RNA比以前預想的要普遍得多，然而還不清楚動物環狀RNA是否具有生物學功能。
與環狀RNA相比，miRNA得到了深入和充分的研究。miRNA是21個核苷酸長非編碼RNA，它會介導效應因子蛋白Argonaute（AGO）到達基因編碼的mRNA上抑制蛋白的產生。在人類中，miRNA直接調控大部分具有各種生物功能的mRNA的表達。然而令人驚奇的是，不知道mRNA是否能夠逃脫miRNA的調控，如果能的話，又是怎樣做的？最近發現了一個以序列特異性方式移除miRNA的機理，這個機理是基於將目標位點做為誘餌或miRNA海綿。帶有miRNA結合位點的RNA如果表達量足夠的話，會將miRNA從其靶點上移除。然而，所有已報導的哺乳動物miRNA海綿只有一個或兩個可以結合同樣miRNA的位點而且表達也不高，這樣就限制了它們的能力。
為系統確認在動物體內的環狀RNA，我們通過篩選RNA-序列數據的方式來尋找環狀RNA。與以前的方法相比，我們的計算分析方法可以在任何基因組區域內發現環狀RNA，具有長（100個核苷酸）閱讀優勢，可以預測連接RNA末端的受體和供體的剪接位點。我們不依賴於雙向測序（paired-endsequencing）的結果或已知的剪接位點。使用發表過的以及我們自已的測序數據，通過我們的方法在人和小鼠的組織中以及在線蟲不同發育階段發現了數以千計的環狀RNA。大量的環狀RNA似乎具有組織或發育階段特異性表達。我們核實了這些數據，發現測試的環狀RNA穩定，具有很好的表達，而且在預測的位點進行成環。環狀RNA明顯在保守核苷酸中富集，說明環狀RNA與其他RNA競爭與RNA結合蛋白（RBP）或miRNA的結合。我們綜合了生物化學分析，功能性分析的以及計算分析方法，得到了一個人的環狀RNA，CDR1反義（CDR1as），它可以作為miR-7的負向調控因子，miR-7是一個從環節動物到人都保守的序列。綜上，我們的數據提供了證據說明環狀RNA具有轉錄後調節的重要作用。
環狀RNA具有複雜的表達模式
為充分確認在動物中穩定表達的環狀RNA，我們在RNA序列讀取中篩選剪接點，這些剪接點是由外顯子上一個受體5』端剪接點和一個下遊的供體3』端剪接點組成（頭對尾）（圖1a）。由於標準RNA表達信息譜多含有聚腺苷酸化的RNA，我們使用核糖體缺失的RNA的數據（ribominus）以及隨機引物。這些數據以前在哺乳動物中用於尋找混雜的外顯子。然而這種方法並不是特別設計尋找環狀RNA的而且（1）只能用於已存在的外顯子-內含子注釋，這樣錯失了從內含子轉錄的或未注釋轉錄物中的RNA；（2）不能明確認定用於成環的剪接位點；（3）需要假設在雙端測序中每對匹配來源於同一個RNA分子。為有一個更客觀的方法來尋找環狀RNA，我們設計了一個在核糖體缺失的數據中確認線性和環狀剪接事件的算法。首先，我們濾出了一直與基因組一致的閱讀序列，留下了剪接過的序列。然後，我們對每個待選閱讀序列的端區進行不依賴基因組的圖譜分析，來尋找唯一的錨定位置。最後，我們要求（1）錨點對比可以延伸到原始閱讀序列對比完成；（2）被預測的斷點兩側是GU/AG剪接信號。不唯一的圖譜以及不明確的斷點都被棄用。我們從錨點對比的反向（頭到尾）檢測到了成環剪接（圖1a）。我們的方法也復原了幾萬個已知的線性剪接事件。我們通過模擬閱讀以及對真正測序數據各種不同排列的方法，估算出了敏感度（>75%）和假陽性率（FDR< 0.2%）。然而，對核糖體缺失進行環狀RNA的抽提和測序的實驗方法效率很低，因此降低了總的敏感度。
我們得到了HEK293（核糖體缺失）的數據並結合了人的白細胞數據，從中檢測到1,950個環狀RNA，每一個確認至少通過兩次獨立的跨界閱讀完成（圖1b）。預測那些能產生環狀RNA的基因的表達僅僅有一點點向高表達值移動（補充圖1d），說明環狀RNA不僅僅是剪接體不常見的錯誤造成的。我們還在小鼠中確認了1,903個環狀RNA（大腦，胚胎腦，誘導分化的胚胎幹細胞，補充圖1f）；其中的81個與人的環狀RNA相同。為查明環狀RNA是否存在於動物的其他進化枝中，我們使用了從線蟲不同發育階段得到的測序數據並且檢測到了724個環狀RNA，每一個確認至少通過兩次獨立的閱讀（圖1c）。
大量的環狀RNA似乎特異性表達在某種細胞或某個發育階段中（圖1bc，補充圖1e）。比如，has-circRNA2149在CD19+白細胞中有13個特殊的跨頭尾閱讀但在CD34+白細胞，中性粒細胞或HEK293細胞中則檢測不到。相似的是，大量的線蟲環狀RNA似乎只表達在卵母細胞中，而在單或雙細胞的胚胎中則沒有。
我們使用RefSeq資料庫和一個非編碼RNA目錄表對人的環狀RNA進行注釋。85%的人環狀RNA與已知基因的正義鏈一致。它們的剪接位點通常跨一到五個外顯子（補充圖1g），而且與編碼外顯子重疊（84%），但這種情況中只有65%是兩個參與成環的剪接位點都是已知的剪接位點（補充表2），證實了我們所採用方法的優點。所有環狀RNA中的10%與已知的轉錄物的反義相一致，有一小部分與UTRs，內含子以及基因組未注釋區相一致（圖1d）。人環狀RNA的例子如圖1e。
我們分析了環狀RNA序列的保守性。由於基因組序列是不同程度進化選擇的目標，我們研究了三種功能不同亞型的環狀RNA。基因間和幾個內含子的環狀RNA表現溫和但在保守的核苷酸中明顯增多（補充圖1h，i）。為分析含編碼序列的環狀RNA且這樣具有高保守性，我們選擇了223個人的環狀RNA，它們在小鼠中具有同源環狀RNA，而且完全由編碼序列組成。對照（線性）外顯子是隨機挑選的，為與相關的保守性匹配，採用第一個和第二個密碼子相同的外顯子。帶有保守成環性的環狀RNA在第三個密碼子的位置上要比對照更具有保守性，說明除了在蛋白質水平之外，在核苷酸水平上進化的約束。概括來講，我們確認了大量的具有複雜表達模式的環狀RNA，它們大都但不完全由編碼外顯子衍生而來。序列的保守性說明至少有一部分環狀RNA含有功能性序列組分。
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Figure1 Detection, classification andevolutionary conservation of circRNAs.
a，Thetermini of junction-spanning reads (anchors) align sequentially to the genomefor linear (top) but in reversed orientation for head-to-tail spliced reads(bottom). Spliced reads must distribute completely to anchors, flanked by AG/GU(Methods). b, c,circRNAs in human cell types (b) and nematode stages (c). d, Genomic origin of human circRNAs.A total of 96% of circRNAs overlap known transcripts. e, Examples of human circRNAs. The AFF1 intronis spliced out (Supplementary Fig. 2e). Sequence conservation: placentalmammals phyloP score (Methods), scale bar, 200 nucleotides.
f,A total of 223 human coding sequence circRNAs with mouse orthologues (green)and controls (black) with matched conservation level (inset: mean conservationfor each codon position (grey), controls (black); x axis, codon positions; y axis, placental mammals phyloPscore; see also Methods and
Supplementary Fig. 1j, k). Third codon positions aresignificantly more conserved (P,4310210,Mann–Whitney U-test, n5223).
圖1 環狀RNA的檢測，分類以及進化保守性。
a，跨越剪接點的閱讀邊界與基因組的序列對比，上半部分是線性的，下半部分是反方向頭對尾的剪接後閱讀。剪接後閱讀一定要與錨點對齊，兩側是AG/GU。
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b，人體細胞中的環狀RNA；c，線蟲發育中的環狀RNA；d，人環狀RNA起源。共有96%的環狀RNA與已知轉錄物重疊。
e，人環狀RNA例子。AFF1的內含子已經被剪接掉了（補充圖2e）。序列保守性：哺乳動物胎盤phyloP分數。f，共有223個人的編碼環狀RNA與小鼠有同源物（綠色）和對照（黑色）帶有匹配的保守水平（內圖顯示，每個密碼子保守分值的均值，對照是黑色；X軸是密碼子位置；Y軸是哺乳動物胎盤phyloP分值，參見補充圖1jk）。第三個密碼子明顯保守得多。
拙評：
a是方法示意圖，也是這篇文章值錢的地方之一。道理看起來不複雜，就是把一般情況下的mRNA剪接過程掉了個個，結果就成環了。
b和c是韋恩圖，分別展示了人和線蟲的環狀RNA的分布的多樣性。嚴格來說具體的意義不大，比如人的韋恩圖，在這裡用的是幾個代表性很一般的（CD19+，CD34+）的集合，線蟲的例子稍微好一點。當然，這幅圖的工作量不小，對以後展開某個特定領域的工作幫助會很大。
d是韋恩圖，這個也可以叫歐拉圖。這個圖的實際意義比前兩個大得多。本文說的主要是環狀RNA，所以在得到的1,602個包含編碼的環狀RNA中的分布很大程度上決定其意義。注意，在這張圖裡，作者用的最醒目的顏色是深藍，就是左上角表示含有反義編碼的那部分，雖然只有10%，但它是本文研究的重點。其實如果按照比例的話，重點應該是最大的CDS-exons那一塊，佔62%，顯然更具有代表性，但故事遠遠不如antisense那樣動人。
e是給了幾個人的環狀RNA的例子，說明了幾種情況，沒什麼大意義。
f是想說明環狀RNA的高保守性。這裡多說兩句，這篇文章還有一個有意思的特點，就是在文章的方法部分往往含有很多結論性的東西，當然原因是多方面的。比如這個環狀RNA保守性分析，說服力並不那麼強，有些數據不放在正文或圖示（圖示是正文的一部分）中也許更好。這個圖在方法中說的很明白，223個circRNA最後得到的是81個具有保守性，還不到一半。
圖1總結，a是核心，d很重要，其他的都是修飾。
關於圖1的八卦是b和c；（一定要努力實現八卦最重要的，但a和d實在沒什麼可說的！)。圖1中，b和c採用的是韋恩圖，英語叫Venndiagram，由英國人JohnArchibald Venn 創造於十九世紀。其實歷史表明，大名鼎鼎的萊布尼茨就早於韋恩使用類似的圖來闡述邏輯問題，只不過韋恩讓這些圖更加著名（也讓他自己更加著名樂！）
約翰-韋恩（John Venn，1834-1923）1834年生於英格蘭約克郡赫爾市，父親是亨利-韋恩，母親是瑪莎-賽克斯。小韋恩很不幸，母親在他三歲的時候就去世了。小韋恩的父親是一個新教的追隨者，一生擔任牧師以及其他教職。小韋恩從小被嚴格培養，希望能夠繼承父業成為牧師。小韋恩19歲（1853）時入讀劍橋大學岡維爾凱斯學院，對現代人來說有幾個名人出自這一學院，一個是發現血液循環的威廉-哈維（WilliamHarvey），他比小韋恩要早150年！還有一個現在仍健在的傳奇大物理學家霍金，當然他比小韋恩要晚100年！。韋恩1857年畢業，1859年成為牧師，並於1862年回到劍橋成為講師講授倫理道德科學。
約翰-韋恩的主要興趣在邏輯學，他先後發表了幾篇這方面的文章。1866年，他發表了「TheLogic of Chance」，在文中他引入了概率中的頻率理論；1881年他發表了「Symbolic Logic」，在文中他正式介紹了韋恩圖；他還在1889年發表了「ThePrinciples of Empirical Logic」。
1883年，約翰-韋恩被選為皇家學會成員。1923年，約翰-韋恩逝於劍橋。
約翰-韋恩有一個兒子，名字也叫約翰-韋恩，是英國經濟學家，並擔任很長時間的劍橋大學女王學院院長。
上面是約翰-韋恩的照片，看上去非常嚴肅，想像中邏輯學家就應該是這個樣子。下面是那個著名的彩色玻璃窗。
在劍橋大學Caius 學院的彩色玻璃窗上有為了紀念約翰-韋恩而製作的圖案，他從1903年起一直擔任Caius學院的院長直到逝世。
韋恩圖是用於顯示元素集合重疊區域的圖示。它既可以表示一個獨立的集合，也可以表示集合與集合之間的相互關係。最常見的是三元韋恩圖，上過美術課就一定會記住。
這個圖表示了三個集合之間可能的所有組合。那麼四個集合就是文章中所用的橢圓形式了：
注意到了麼？在三元韋恩圖中最大的不同集合數是7；在四元中這個數是15；在五元中這個數是多少，為什麼？
韋恩圖也創造了數學問題，最著名的是對稱問題，就是滿足什麼樣條件的韋恩圖是對稱的呢？答案是質數元素的韋恩圖是對稱的。來個n=5 看看：
看著沒那麼複雜，不過你可以知道，直到今天，還常常可以見到有關韋恩圖的數學問題討論發表在頂級學術雜誌上。好了，我們回來看文章！
50個預測的環狀RNA的特性
通過實驗在HEK293細胞中驗證我們對環狀RNA的預測。反轉錄後通過實時PCR檢測頭對尾的剪接，使用不同引物進行Sanger序列測定（圖2ab）。在環狀RNA隨機選擇的23個剪接位點中19個得到了驗證（83%），說明了我們方法的準確性高（表1）。相反，在白細胞中預測的7個環狀RNA中有5個在HEK293中檢測不到，說明了環狀RNA表達的特異性。
頭對尾的剪接也可能由反式剪接或基因組重排產生。為排除這些可能性以及可能產生的PCR人工產物，我們成功地通過RNaseR驗證了人的環狀RNA的非敏感性，RNaseR是一種降解線性RNA分子的核酸外切酶，我們通過NorthernBlot，採用跨頭對尾剪接位點的探針，驗證了RNaseR對人的環狀RNA沒有降解作用（圖2c）。我們定量測定了21個環狀RNA對RNaseR的抗性，而且通過qPCR驗證了頭對尾的剪接。所有測量的環狀RNA至少比GAPDH對RNaseR的抗性高10倍（圖2d，補充圖2a）。我們推測環狀RNA應該比mRNA正常情況下翻轉慢得多。確實，我們發現在阻止轉錄24小時後環狀RNA仍然非常穩定，穩定程度超過內參基因GAPDH（圖2e，補充圖2b）。在小鼠的腦組織中，我們也驗證了與人同源的小鼠的環狀RNA（3/3）。在線蟲中，從生殖細胞和早期胚胎中預測的20個環狀RNA有15個在混合的樣品中得到了驗證（補充圖2d，補充表3）。
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Figure 2 | CircRNAs are stable transcripts with robustexpression. a, Human(hsa) ZRANB1 circRNA exemplifies the validationstrategy. Convergent (divergent) primers detect total (circular) RNAs. Sanger sequencing confirms head-to-tail splicing. b, Divergent primers amplify circRNAs in cDNA but not genomic DNA(gDNA). GAPDH, linear control, size marker in base pairs. c, Northern blots of mock (2) and RNase R (1) treated HEK293 total RNA with head-to-tial specific probes for circRNAs. GAPDH, linear control. d,e, circRNAs are at least 10-fold more RNase R resistant than GAPDH mRNA (d) and stable after 24 h transcription block (e) (qCPR; error bars indicate standard deviation).
圖2 環狀RNA具有穩定的轉錄物和表達
a，人的ZRANB1 環狀RNA驗證策略示範圖。收斂（擴散）引物探測到整個環狀RNAs。Sanger測序證實頭對尾的剪接。b，擴散引物在cDNA中擴增環狀RNA，不擴增基因組DNA（gDNA）。GAPDH是線性對照。
c，Northern Blot, GAPDH 作為對照。d，e，環狀RNA比GAPDHmRNA 對RNaseR的抗性至少高10倍。
圖2總評：工作量及技術含量都不大，屬於過渡階段數據，沒有太多值得討論的地方。
環狀RNA CDR1as 與AGO蛋白密集地結合
帶有多個miRNA結合位點的穩定的轉錄物可以以「miRNA海綿」的方式起作用。我們把環狀RNA的目錄與轉錄物的注釋結合起來分析，並假設成熟環狀RNA中沒有內含子。我們篩選與保守miRNA家族種子匹配的保守序列。（在方法中作者介紹了具體的做法，就是將環狀RNA作為靶序列，普查有哪些已知的miRNA可以與其作用。一個假定的miRNA靶點是一個6個核苷酸長的序列，這個序列與成熟的miRNA上第2到第7位的序列呈反式互補。同時補充說明，通常情況下稱之為保守的。）當對同一個miRNA家族進行保守匹配計數時，與編碼序列或3』端UTR序列相比環狀RNA明顯富集（P<2.96 X 10 -22, n = 3,873; P < 2.76 X 10 -21, n =3,182; Mann-Whitney U-test）。
作為一個極端的例子，我們發現已知的人的環狀CDR1as 上具有許多保守的miR-7的種子匹配（即結合位點）。為檢測CDR1as是否與miRNA結合，我們分析了miRNA效應子AGO蛋白的生物化學，在整個轉錄組範圍的結合位點數據。我們對人的AGO作了四次獨立的PAR-CLIP（photoactivatable-ribonucleoside-enhancedcrosslinking and immunoprecipitation）實驗，而且將結果與發表過的數據相結合。PAR-CLIP 主要基於通過紫外將RNA與蛋白交聯，然後對結合到特異的RNA結合蛋白上的RNA進行測序。在大量高密度的AGOPAR-CLIP的讀數中，長度為1.5kb的CDR1as 基因位點脫穎而出（圖3a），而其他九個合併的檢測其他RNA結合蛋白庫的讀數基本不存在。需要注意，CDR1基因正義編碼的轉錄物沒有產生PAR-CLIP讀數，這個轉錄物起初是從類腫瘤性小腦變性（paraneoplasticcerebellar degeneration）患者體內以自抗體的攻擊目標驗證出來的。
對於32個脊椎動物的序列分析發現，miR-7是具有保守種子匹配的唯一的動物miRNA，這樣可以解釋AGO與CDR1as轉錄物的結合。人的CDR1as包含74個miR-7種子匹配，其中的63個至少在一種其他生物中存在。不同位點間的保守性很小，說明miR-7的結合位點可能具有功能性（圖3b）。對預測的環狀RNA-miRNA複合物的二級結構分析表明種子外miR-7減少的鹼基配對（圖3c）。32種脊椎動物序列中有大約1500個miR-7的互補位點，但在miR-7位置12以外則沒有一個互補位點的存在（只有三個可以形成一個11個核苷酸的雙層複合物）（補充表4）。哺乳動物Argonaute蛋白的切割需要10和11位的互補，而且依賴12位以外的延伸互補。這樣，CDR1as似乎正好可以大量結合miR-7而又不被miR-7所切割。
單分子成像技術展示了分散的，大多數情況下處於細胞質中的CDR1as的表達（HEK293細胞中），這與它miRNA海綿功能相一致（圖3d，補充表5）。通過NorthernBlot 檢驗了CDR1as的成環性（圖3e）。缺口實驗證實了環狀CDR1as可以被線性化而且會被降解（補充圖5a）。在HEK293細胞的RNA中，除了環狀CDR1as外沒有檢測到線性的CDR1as（補充圖5b）。對環狀RNA的表達水平進行了定量測定，方法是實時PCR，使用發散性引物，通過標準曲線法進行定量（補充表6）。CDR1as表達量很高（15-20%對GAPDH的表達，圖3f）。通過HEK293RNA-seq 的數據，估算GAPDHmRNA的拷貝數（大約每個細胞1400個分子）可以知道每個細胞中CDR1as可能最多結合20,000個miR-7分子。
如果CDR1as的功能是miR-7的海綿，那麼它的破壞將會引發miR-7目標的表達下調。我們在HEK293細胞中敲除了CDR1as，然後檢測發表過的miR-7目標基因的表達，使用的方法是實時定量PCR，採用外部尖刺的標準。所有的八個miR-7的目標基因都下調了，內參基因也都下調了。另外，微串（nanostring）技術證實有許多基因下調了。還有，通過病毒引入小髮夾RNA的方法穩定減少CDR1as的表達引起體外創傷修復中細胞遷移的明顯減少（補充圖5阿附，補充表7）。這樣，敲除CDR1as會影響HEK293細胞，但我們無法說明這是miR-7的特異性作用，因為它可能是非直接的，或者是不依賴於miR-7的CDR1as的功能。
Figure 3 | The circRNA CDR1as is bound by the miRNAeffector protein AGO, and is cytoplasmic. a, CDR1as is densely bound by AGO (red) but not by unrelatedproteins (black). Blue boxes indicate miR-7 seed matches. nt, nucleotides. b, c, miR-7 sites display reducednucleotide variability across 32 vertebrate genomes (b) and high base-pairing probability within seed matches (c).
圖3 環狀CDR1as與miRNA效應子蛋白AGO結合，環狀CDR1as存在於細胞質中。
a，CDR1as密集地與AGO（紅色）結合，但不與不相關蛋白（黑色）結合。藍色區域是miR-7種子匹配區。b，c，在32種脊椎動物基因組中miR-7位點展示減少的核苷酸可變性（b）；以及在種子匹配中鹼基的高配性（c）。
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d, CDR1as RNA is cytoplasmic and disperse (whitespots; singlemolecule RNA FISH; maximum intensity merges of Z-stacks). siSCR, positive; siRNA1, negative control. Blue,nuclei (DAPI); scale bar, 5 mm (see also Supplementary Fig. 10for uncropped images). e, Northern blotting detects circularbut not linear CDR1as in HEK293 RNA. Total, HEK293 RNA; circular, head-to-tail probe; circ1lin, probe within splice sites; IVTlin., in vitro transcribed, linear CDR1as RNA. f, Circular CDR1as is highly expressed (qPCR, error bars indicate standard deviation). g, CDR1as. Blue, seed matches; darderd, AGO PAR-CLIP reads; bright red, cross linked nucleotide conversions.
d，CDR1asRNA 是處於細胞質中分散的。（白點；單分子RNAFISH）
e，NorthernBlot 在HEK293細胞RNA中檢測到環狀CDR1as但沒有線性CDR1as。
f，環狀CDR1as是高度表達的。
g，CDR1as 示意圖。藍色，種子匹配；暗紅，AGOPAR-CLIP閱讀；鮮紅，交聯的核苷酸形式。
圖3評論：
圖3主要展示CDR1as的性質，說明它在細胞質中的存在情況。值得注意的是其中採用了單分子成像技術。由其性質，文中強調的與miR-7結合的特點，引出下面有關的功能上的內容。
CDR1as與miR-7在腦組織中的共表達
如果CDR1as確實與miR-7具有相互作用，那麼它們一定是共表達存在的。miR-7在神經組織，胰腺和腦垂體中具有很高的表達水平。HEK293可能是一種從胚胎腎中神經細胞前體衍生的細胞系，除此之外，我們定量分析了CDR1as和miR-7在不同的小鼠組織以及胰島分化的MIN6細胞中
的表達情況（圖4a）。CDR1as和miR-7在腦組織中都具有高表達水平，但CDR1as在非神經組織中表達很低或沒有表達，包括miR-7高表達的其他組織。qPCR數據說明CDR1as僅僅在成年和胚胎的小鼠腦組織中是呈環狀的（補充圖5gh）。這樣，CDR1as與miR-7似乎在神經組織中特異性地進行相互作用。確實，通過原位雜交方法，我們在胚胎小鼠（E13.5）的腦組織中發現CDR1as和miR-7具有相似但不完全相同的表達模式（圖4b）。非常特異地，CDR1as和miR-7在發育的中腦區域具有共同高表達的特點。因此，CDR1as是高表達的，穩定的，存在於細胞質中的，不呈線性存在而且與miR-7共享表達結構域的環狀RNA分子。這些性質再加上CDR1as中存在的miR-7結合位點，說明CDR1as是神經組織中可能的環狀的miR-7的海綿。
Figure 4 | CDR1as and miR-7 have overlapping and specificexpression in neuronal tissues. a,Among mouse tissues and MIN6 cells (qPCR, relative to cerebral cortexexpression; error bars indicate standard deviations; see Supplementary Fig. 9afor miR-122 control) neuronal tissues co-express miR-7 and CDR1as. b, Insitu staining of CDR1asand miR-7 in mouse embryo brain E13.5 (U6 and miR-124, positive control;scrambled probe, negative control). Scale bar, 1mm.
圖4 CDR1as與miR-7在神經組織中具有重疊和特異性的表達。
a，小鼠組織以及MIN6細胞中CDR1as和miR-7的共表達情況，qPCR數據（以大腦皮層的表達為參照）。b，小鼠胚胎（E13.5）腦的CDR1as和miR-7的原位雜交圖。
圖4總結：
圖4進一步強調了CDR1as的性質，即在組織中的表達分布，工作量很大。另外要注意到的一個細節是miR-7在Colon中具有很高的表達，但CDR1as則沒有，說明在Colon中有類似CDR1as的其他功能分子的存在。還有在cortex和hippocampus中CDR1as的表達都遠遠高於miR-7，說明CDR1as可能還有其他的功能。
miR-7 和CDR1as在斑馬魚中的作用
如果在動物模型中敲除CDR1as則會提供很多信息。然而，這種敲除將會影響到CDR1蛋白，那樣的結果是未知的。如果使用斑馬魚做動物模型則可以克服這個問題。根據我們的生物信息學分析，斑馬魚的cdr1的位點是缺失的，而miR-7卻在胚胎腦組織中高度表達。因此，我們可以檢測是否miR-7會產生一種功能失去的表型，能否使用引入哺乳動物CDR1asRNA的方法來誘導這種功能缺失表型的發生。在使用9ng劑量的miR-7嗎啉代時，胚胎並沒有整體上的形態缺失變化，但分別在兩種不同的，獨立的遺傳背景下可以重複性地產生腦發育缺陷現象（圖5ab）。特別是，70%的樣本清晰一致地具有中腦體積減少的現象，另外還有5%的樣本完全失去了中腦。需要說明的是，處於大腦前側的端腦（encephalon）的體積並沒有受到影響。通過共聚焦三維堆積方法對整個大腦的體積也都作了測量（圖5c，補充圖7）。中腦體積的減少與其他動物miR-7被抑制的現象時一致的（補充圖6d）。這些數據說明miR-7功能缺失導致中腦體積的減少。
為檢測CDR1as是否在體內可以像miR-7的海綿樣具有功能，我們在斑馬魚的胚胎中注射兩種質粒，一種是可以表達線性CDR1as的，另一種是可以在人細胞中表達環狀CDR1as的（圖5de）。qPCR確定在斑馬魚中表達了環狀CDR1as，而這些魚可重複性地發生了中腦體積減少的現象（圖5gh）。同樣，在小鼠中注射體外轉錄的部分小鼠CDR1asRNA但不是從另一條鏈上來的RNA可以明顯減少中腦的體積（補充圖6gi）。因此這一表型是由CDR1asRNA引起的，而不是非特異性RNA或DNA注射引起的。這些結果提供證據說明人/小鼠CDR1as轉錄物在體內是具有生物活性的，可以產生像miR-7被抑制那樣的對腦發育的損傷。中腦體積的減少可以通過注射miR-7前體部分恢復（圖5fg），說明CDR1as表達的生物學效應至少部分由其與miR-7的相互作用而產生。
Figure 5 | In zebrafish, knockdown of miR-7 or expressionof CDR1as causes midbrain defects. a, b, Neuronal reporter (Tg(huC:egfp)) embryos (top, light microscopy) 48h post fertilization (bottom, representative confocal z-stack projections; blue dashed line, telencephalon (TC)(control); yellow
dashed line, midbrain (MB)). Embryos after injection of 9 ngmiR-7 morpholino (MO) (b) display a reduction in midbrainsize. Panel a shows a representative embryoinjected with 15 ng control morpholino. c,Threedimensional volumetric reconstructions. d,Emptyvector control. e, Expression vector encoding human circular CDR1as. f, Rescue experiment with miR-7 precursor. g, Phenotype penetrance (% of embryos, miR-7 MO, n=135; uninjected, n=83; empty vector, n=91; linear CDR1as, n=258; circular CDR1as, n=153; circular CDR1as plus miR-7 precursor, n=217). phenotype distribution derived from at least three indepenent experiments. Scale bar, 0.1mm. ** P<0.01; ***P<0.001 in Student t-test for normal midbrain, reduced midbrain (see also Supplementary Fig.6). h, Phenotype quantification (Methods). Error bars indicate standard deviation n=3 per group.
圖5 斑馬魚中通過CDR1as敲除miR-7導致中腦缺陷。
a，b，受精48小時後胚胎神經元報導基因代表性共聚焦z-軸堆積成像；藍色虛線，端腦（對照）；黃色虛線，中腦。注射9ngmiR-7 嗎啉代（morpholino,MO）（b）顯示中腦體積減少。組圖a表示注射15ng對照嗎啉代。c，三維體積重建。d，空質粒對照；e，表達人環狀CDR1as；f，恢復實驗，採用miR-7前體；g，表型外顯率（胚胎%，miR-5MO，n=135；未注射，n=83；空質粒，n=91；線性CDR1as，n=258；環狀CDR1as，n=153；環狀CDR1as+miR-7前體，n=217）。h，表型定量統計。
圖5總結：
這是本文第二賣點，相當於做了一個knock-out鼠之後發現它是 lethal的，算是很大的發現。圖很一般，就是要說明環狀CDR1as的功能，作為miR-7的海綿，作用結果使中腦發育缺陷。值得注意的是，由於表型決定了CDR1as功能的重要性，也就決定了這篇文章的重要性，因此對於表型的鑑定還是很認真地，算了一下，總共統計中有937個zebrafish的胚胎處理，工作量還是很大的。
討論
我們已經顯示了在動物基因組不同位置有幾千個環狀RNA的表達（比如，從編碼和非編碼外顯子中，基因間區域或轉錄反義到5』和3』UTRs），它們的表達呈複雜的組織特異，細胞類型特異，或是發育階段特異的方式。我們提供的證據說明CDR1as在腦組織中通過與miR-7的結合而充當轉錄後調解物的作用：（1）CDR1as 密集地與miRNA效應因子分子結合；（2）CDR1as含有74個miR-7種子匹配位點，大多高度保守；（3）CDR1as呈高表達，穩定存在於細胞質中；（4）CDR1as與miR-7在小鼠胚胎腦組織中共享特異性表達區域；（5）人/小鼠的CDR1as在體內呈環狀形式，線性物檢測不到；（6）人/小鼠的CDR1as注射到斑馬魚中會在腦中出現與miR-7敲除相似的表型。也許斑馬魚對人的CDR1as的成環作用不完全，但與線性CDR1as相比較，中腦的表型還是很明顯的。雖然兩種DNA質粒攜帶的是同一個啟動子，以相同的劑量進行注射，我們仍然不能排除中腦發育缺陷是由其他因素引起的可能。但是由於CDR1as或環狀RNA異常的穩定性，我們的數據說明環狀RNA可以用作miRNA或RBP的抑制劑。以後的研究應該闡明CDR1as如何線性化然後靶定目標進行降解的。miR-671可以誘導CDR1as的降解，因此CDR1as可能的功能是將miR-7帶到亞細胞區域，在那裡miR-671可以促進其釋放miR-7。已知的miR-7目標比如PAK1和FAK1的功能支持這種想法。
在斑馬魚中由於CDR1as表達引起的表型通過表達miR-7隻能部分地恢復，說明CDR1as的功能不只是捕獲miR-7。這一想法得到的實驗支持是在成年小鼠腦海馬部位原位雜交顯示只有CDR1而沒有miR-7的信號（補充圖9b）。那麼環狀RNA除了成為海綿之外還可能有什麼功能呢？作為單鏈RNA，CDR1as可能，比如，與目標mRNA的反式3』UTRs結合來調節其表達。甚至可能miR-7與CDR1as的結合是為沉默這些反式作用活動。還有，CDR1as可能與大的RNA或蛋白質複合物的組裝相關，也許與其他低複雜性分子具有相似性。
還有多少個其他環狀RNA存在呢？在本研究中，我們通過序列數據確認了人有2,000；小鼠有1,900；線蟲有700個環狀RNA；而且我們通過實驗確證了最常見的50個。然而我們只是通過一些具有局限性的簡易手段檢測了幾個組織/發育階段的情況。因此，真正的環狀RNA的數量要大得多。儘管CDR1as是一個極端的例子，但許多環狀RNA都具有保守的種子匹配。比如，SRY位點產生的環狀RNA具有小鼠miRNA的種子位點。因此，環狀RNA可能與其他RNA競爭與miRNA的結合。序列分析表明當編碼外顯子表達環狀RNA時，它就承擔了額外的可能的調節功能，而基因間或內含子產生的環狀RNA則通常只顯示弱保守性。由於我們檢測了成千的環狀RNA，因此會有趣地推測到外顯子隨機的成環作用很容易得到進化，而且可能為得到穩定的表達良好的具有調節功能的RNA的快速進化提供一個機理。還要提醒的是，我們在人的環狀RNA中檢測到了許多病毒miRNA的種子匹配。然而，沒有理由認為環狀RNA的主要功能一定是與miRNA結合。比如像在細菌中，miRNA海綿的捕獲機制對RBP同樣重要。同樣，環狀RNA可以存儲，分類或找到RBP。概括來說，我們的數據說明環狀RNA形成了一類轉錄後調節物，它們可以和其他RNA競爭與miRNA和RBP的結合，通常情況下的功能是調節局部的RBP，RNA或其位點的濃度。
另註：本文審閱過程中，成纖維細胞中環狀RNA被發現。
(正文完)
當期專家評論：
Title: Circlesreshape the RNA world
題目：圓圈重塑RNA世界
Abstract Theversatility of RNA seems limitless. The latest surprise comes from circularRNAs, which are found to counteract the function of another class of regulatoryRNA –the microRNAs.
摘要 RNA的多樣性似乎沒有邊界。最新的驚奇來自環狀RNA，發現它可以反作用於另一種調節性RNA-微RNA。
（正文）
信使RNA編碼蛋白的功能可以被短的microRNA序列的結合而抑制。但microRNA誘導的抑制作用自身又是如何被抑制的一直不得而知。在本期中，Memczak等（333頁）以及Hansen等（384頁）描述了高度穩定的環狀RNA通過結合幾個拷貝的microRNA而終止microRNA抑制mRNA作用的過程。
報導的環狀RNA（circRNA）有被Memczak稱為CDR1as以及被Hanse稱為ciRS-7的，包含可以與microRNA-7（miR-7）結合的大約70個結合位點的高度保守序列，並可以與AGO蛋白形成複合物。後一個環狀RNA是RNA誘導沉默複合物的一部分，這個複合物使miRNA可以識別其目標mRNA。當Memczak與同事將人的CDR1as/ciRS-7表達在斑馬魚的胚胎中時，其效果與減少miR-7的表達時見到的一樣-破壞了中腦的發育。還有，作者的生物信息預測指出在基因組中有幾千個環狀RNA的存在，這與之前的報導相一致。
miRNA所進行的目標抑制是一個有微妙之處的過程。一方面，miRNA上的這些序列可以誘導AGO-介導，通過mRNA與miRNA之間序列互補性激活的，在mRNA第10,11位核苷酸上的內切性核酸酶對mRNA的切割。在目標mRNA被切割後，miRNA被釋放，重新以催化方式去與下一個目標結合。另一方面，miRNA可以通過化學計量的方式與目標mRNA結合得更緊密，這樣miRNA就可以抑制蛋白的翻譯。這種方式使目標mRNA變成了一個儲存miRNA的「水庫」，阻止miRNA進一步抑制其他mRNA。後一種機理說明了競爭性內源RNA（ceRNA）的作用方式。競爭性內源RNA（ceRNA）是一些mRNA，它們與其他mRNA一起分享miRNA-應答組份（MREs），因此與其它mRNA競爭性地與miRNA結合。
象內源性RNA一樣，環狀RNA也可以起miRNA水庫的作用。然而由於環狀RNA對於特異miRNA具有很多結合位點，因此其作用完全是為miRNA提供庇護所。內源性RNA與miRNA的結合不僅阻止了miRNA與其他MREs的結合，同時也可以抑制內援性RNA編碼部分的翻譯。這樣，與環狀RNA相比，內源性RNA以相對複雜的相互作用分子的方式限制翻譯的進行。在特殊分子中也存在其他位點的水庫。這些包括目標模擬物比如在植物擬南芥中的基因IPS1對於假基因PTENP1的誘餌作用，還有可能是與其相關蛋白編碼序列分開的3』端mRNA未翻譯區。
環狀RNA通過消除RNA外切酶的活性來增加自身的穩定性，通常RNA外切酶在RNA分子自由3』或5』端開始進行切割。還有，由於一個環狀RNA上有幾個作為拮抗單一miRNA的結合位點，因此一個環狀RNA就可以一下子從不同目標上抓到許多miRNA。同樣，環狀RNA的解體也可以一下子釋放出很多miRNA，而這些miRNA會去尋找具有共同MRE的mRNA作為目標。事實上，Hansen等大致畫出了環狀RNA解體的機理，miR-671與互補性更強的CDR1as/ciRS-7結合而不是miR-7，導致AGO-介導對這一環狀RNA的切割。
對miRNA進行快照法資料分析發現，miRNA的表達在發育，細胞分化或腫瘤形成的過渡點時期發生很大的變化。在這些過渡點階段，可以通過環狀RNA的方式清除mRNA-miRNA複合物而用另一種不同的miRNA代替。比如，作為一種蠻不講理的方法來清除miRNA時，當細胞從幹細胞開始進行分化時環狀RNA增加表達，這樣可以捕獲在幹細胞中過量表達的miRNA。環狀RNA也可以清除成熟miRNA的另一條鏈，那條鏈可能以令人驚奇的數量存在；或者環狀RNA可能具有治療的功能，將癌症相關的miRNA從促進癌症形成的途徑上移除。然而在所有這些情況中，環狀RNA捕獲miRNA，但miRNA是如何被解離得仍不得而知。
為了以最佳方式運轉，每個環狀RNA上大量的miRNA結合位點也許是在進化選擇的壓力下為了從其目標位點上進攻幾乎所有某種特異的miRNA。如果情況真的如此，那麼一個細胞中某種環狀RNA上miRNA結合位點的數量與這種環狀RNA的拷貝數的乘積將告訴我們某一個特異性miRNAMRE的總強調。許多miRNA在每個細胞中大約的拷貝數是103-大致上是將其完全清除所需環狀RNA位點數的下界。然而，如果環狀RNA要在與mRNA競爭miRNA的結合中取得勝利，它們就需要有比mRNA更強的與miRNA的親和力。高親和力可以通過熱動力學的方式建立在環狀RNA序列中，但還需要細胞中與其它相關性MREs總量相關的過量的環狀RNA編碼的miRNA的結合位點。確實，模型製作者將很快在這個領域中到處可見。
維護大致21個核苷酸長的miRNA沒有改變在經過主要進化包括環形RNA後（圖1）。對於每一個miRNA的選擇壓力無疑很高：一個miRNA的序列一定要自我成對形成髮夾式miRNA前體；它一定要與目標mRNA配對；它也一定要與終結或調節目標相互結合的位點配對。雖然有大量的可能miRNA序列，miRNA數量上的改變很小，說明在剩餘的進化空間中革新受到限制，換句話說，miRNA達到了分子的完美。在整個動物進化過程中，自然採用一套相對穩定的編碼基因，而miRNA的革新，通常來講，更離不開全新的序列的創造。也許髮夾式miRNA前體輕而易舉地以有效調節因素的方式出現-而且「數字式地」適合大量的基因組非編碼序列，包括環狀RNA-這種因素可能會成為進化的驅動者。
作為補充說明，我們需要一個更好的環狀RNA的命名系統。「ciRS-7」說明它與miR-7結合，因此假設這類其他的環狀RNA也會清除地對應一個miRNA。「CDR1as」假設這個環狀RNA將與一個命名了的基因有某些聯繫-在這種情況下，是一個小腦變性相關基因的反義序列。基因組中有幾千個這樣的環狀RNA，它們需要自己的編號系統，我建議把這個叫做circR-1。
查看原圖
Figure 1 | Constraints on evolutionary change in microRNAs. MicroRNAs (miRNAs) liein a fitness valley constrained by their numerous interactions, which includethose with the hairpin structure of the precursor miRNA (pre-miRNA), the many targetmRNAs and other RNAs that terminate or modulate miRNA binding to targetsequences by competing against them. The latter category includes competingendogenous RNAs (ceRNAs), pseudogene decoys and miRNA mimics. Two studies1,2 introduce circular RNAs(circRNAs) as another constraining factor. MRE, miRNA-response element.
圖1 microRNA 進化改變的限制。miRNA處於健身谷中，被大量的相互作用限制在那裡，這些限制性的相互作用包括帶有髮夾結構的miRNA前體，許多目標mRNA和其他通過競爭來終結或調節miRNA與目標序列的結合的RNA。後面這類包括競爭性內源RNA（ceRNA），假基因誘餌以及miRNA模擬物。
（圖中說明的是miRNA在進化過程中的各方面壓力，因為評論的文章中側重環狀RNA對miRNA的作用，因此評論直接用miRNA的進化來說明。圖本身很漂亮，屬於比較fancy的那種。）
（全文完）
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