RNA幹擾，圖片來自Richard Robinson from Wikipedia。
2017年4月30日/生物谷BIOON/---最近的一項利用CRISPR開展的研究駁斥了多年來利用RNA幹擾（RNA interference, RNAi）針對一種得到很好研究的癌症藥物靶標的研究結果[1]。但是對作為一種篩選工具的RNAi而言，這是將它釘在棺材裡的最後一顆釘子嗎？
大量的RNAi研究已證實編碼一種蛋白激酶的基因MELK對癌細胞是必需的。當美國冷泉港實驗室的研究人員著手證實癌細胞對MELK基因的依賴性時，他們並未期待會有什麼意料之外的發現。但是，他們隨後發現利用基因編輯工具CRISPR-Cas9剔除MELK基因並未對癌細胞產生顯著的影響[1]。這就與之前的RNAi研究結果完全相反。
當這項研究上個月發表在eLife期刊上[1]時，美國桑福德-伯納姆-普利貝斯醫學探索研究所癌症研究員Alexey Terskikh（未參與這項研究）告訴《科學家》雜誌，「這是一項精心設計的研究。」他補充道，它提供一個例子說明「為何人們應當採用CRISPR作為一種更加嚴格的方法來解決他們提出的問題。」
這項研究絕對不會是駁斥基於RNAi實驗獲得的關於必需基因和潛在的藥物靶標的發現的第一項研究。相反，它進一步證實了多年來的報導：RNAi技術存在重現性差、具有脫靶效應以及有時會導致完全錯誤的結果。
在提到發表在eLife期刊上的關於MELK的這篇論文破壞了人們對RNAi技術的信心時，美國史丹福大學的Michael Bassik說，「恰當地說，RNAi長期以來就存在問題。在某種程度上而言，這項研究確實破壞了人們的信心。當然，如果你閱讀了這篇論文，想知道，『我應當採用RNAi篩選還是CRISPR篩選？』那麼答案就是全部採用CRISPR篩選。」
但是它意味著利用RNAi鑑定新的藥物靶標之路終結了？不一定。Bassik說，「在發表這類籠統的觀點時，你必需非常小心。」他補充道，RNAi盔甲上的這個最新的裂縫「並不意味著RNAi篩選在鑑定藥物相互作用時它是無用的。」
壞名聲RNAi技術利用小幹擾RNA（siRNA）或短髮夾RNA（shRNA）觸發具有互補序列的靶mRNA（即信使RNA）降解，因而抑制細胞中的特定基因表達。在2007年左右，這種技術在鑑定藥物靶標上非常流行，此後，全基因組RNAi篩選準確找出與對化療藥物敏感性增加相關的基因[2]。
但是RNAi的作用機制是非常不精確的。荷蘭癌症研究所的René Bernards（他的實驗室使用過CRISPR和RNAi）說，到目前為止，「我認為每個人都應注意RNAi的脫靶效應。它是這種技術的最大缺點。」導入的RNA分子不僅較低特異性地與脫靶轉錄本序列相互作用[3]，而且它們也不可預測地幹擾調節基因表達的細胞機制。
Bassik說，「這能夠產生非常廣泛的影響」，並且補充道，當這些影響具有毒性時，研究人員可能最終對一種基因在細胞中的作用形成錯誤的看法，「有大量的例子表明製藥公司優先利用RNAi實驗結果來尋找藥物靶標，結果僅發現這些結果是錯誤的。」
最為聲名狼藉的被錯誤識別的藥物靶標之一是蛋白激酶STK33。2009年，研究人員已鑑定出STK33是攜帶著一種已知的癌基因突變的人癌細胞的活力所必需的。這項原始的研究的結果並不能夠在其他的實驗室中得到重複，隨後經證實，它一點也不是必需的[5]，不過在此之前，它作為一種潛在的藥物靶標吸引了製藥行業的大量關注。
此後，隨著CRISPR-Cas9基因編輯技術變得越來越精確，在尋找新的藥物靶標時，人們對這種技術替換RNAi的潛力具有也越來越濃的興趣[5]。多個實驗室（包括Bassik團隊和Bernards團隊）最近利用這兩種技術開展的篩選進行面對面的比較。
Bernards說，「當我們採用CRISPR試劑時，脫靶效應明顯不那麼嚴重。這種技術具有更好的選擇性。」他補充道，根據他的團隊對這種方法的可重複性的比較結果，「明顯的是，CRISPR篩選具有更少的幹擾結果。我認為每個實驗室都得出了相同的結論。」
美國哈佛醫學院的Tim Mitchison（之前研究過MELK）說，結果就是，一些實驗室「真地拋棄了RNAi，而選擇了CRISPR。很多人認為CRISPR發揮得更好。」
還不是最終結局儘管明顯對RNAi篩選缺乏信心，很多研究人員迄今為止並不準備在藥物靶標鑑別上放棄這種技術。RNAi敲降（RNAi knockdown）和CRISPR敲除的工作機制不同：前者部分抑制基因表達，而後者完全抑制基因表達。當考慮藥物開發時，這一區別變得非常重要。
Bernards注意到，「對任何一種藥物而言，實現對靶標100%的抑制是非常罕見的。你可以認為如果你需要完全清除所有的靶蛋白來產生一種表型，那麼藥物產生這種情形的可能性到底有多大？答案很可能是不太可能的。」
他補充道，就目前而言，RNAi可能在這個方面具有優勢，不過CRISPR可能很快會趕上，這多虧CRISPR幹擾（CRISPR interference, CRISPRi）技術[6]。CRISPRi是一種利用CRISPR的特異性調節轉錄受到的部分抑制。
一些研究人員認為儘管存在一些挫折，RNAi可能仍然有用的另一種原因在於相比於在應用時有時使用的有缺陷的方法，過去的錯誤更少地反映在這種技術上。Bernards解釋道，在理想情形下，RNAi敲降結果應當會利用研究人員稱作為「金標準」的方法加以驗證。
他說，「你導入抵抗RNAi的基因版本，比如，靶位點序列發生突變的基因版本，觀察這是否會拯救這種表型」，並且補充道，這個過程在很多針對潛在藥物靶標的RNAi研究中缺乏了，「如果你不這樣做，那麼你會給自己帶來潛在的麻煩。」（毫無意外的是，2013年， MELK在膠質母細胞瘤細胞中接受拯救治療[7]。）
當然，CRISPR仍然有它自己的問題。美國斯隆凱特林癌症紀念中心RNAi核心機構主任Ralph Garippa注意到，僅最近將核酸切割酶Cas9引導到基因組中的特定位點上的嚮導RNA（gRNA）文庫進行改進，實現了較少的脫靶效應[8]。與此同時，他強調道，「脫靶效應不是歸於零，而不是變得更少」，並且補充道RNAi文庫繼續得到改善。Garippa告訴《科學家》雜誌，「對於任何新出現的技術，你必須想方設法克服它的細微差別和缺點。」
與此同時，一種顯而易見的解決靶標鑑定和驗證問題的方法是在進行臨床研究之前，利用CRISPR和RNAi而不是利用單個方法驗證靶標。Bernards說，「我們針對人基因組中的每個基因使用CRISPR和短髮夾RNA試劑。因此，當我們利用CRISPR觀察到一種表型時，我們利用短髮夾RNA進行驗證，反之亦然。我認為這將是比較理想的。」（生物谷 Bioon.com）
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