相關成果---中國科學院 十二五標誌性重大進展

　　一、成果總結： 

　　近年來，幹細胞研究取得了較大進展，幹細胞多能性機制逐步清楚，重編程技術大幅改進，定向分化方案不斷優化，臨床轉化持續加速。以幹細胞移植為核心的再生醫學，作為繼藥物治療、手術治療後的另一種疾病治療途徑，已成為新醫學革命的核心。細胞編程與重編程研究是對生命本質的探索，其對推動幹細胞研究走向應用和臨床都具有重要的作用，加強相關研究對未來人類健康的保障至關重要。

　　在「十二五」期間，中國科學院動物研究所研究員、中國科學院院士周琪帶領動物所幹細胞研究團隊對細胞編程與重編程研究進行了整體布局，從基礎理論、核心技術、轉化應用幾個層面開展系統研究，在過去五年中取得了一系列突破性的研究成果，建立了多項創新性的技術體系，在國際國內同領域的研究中起到了重要的引領和推動作用。研究團隊及成果獲得了中科院傑出科技成就獎、國家自然科學二等獎等多個獎項，並入選2012年度中國科學十大進展，受到國際國內同行和媒體的廣泛關注。

　　(1) 首次通過單倍體幹細胞獲得轉基因動物 

　　周琪研究組構建了孤雄發育的單倍體胚胎並建立了孤雄單倍體胚胎幹細胞系（ahES cells），並發現其具有替代精子與卵母細胞「受精」並產生健康可育個體的能力。對單倍體胚胎幹細胞進行基因修飾可以直接遺傳給後代，與傳統的基因工程相比極大提高基因修飾的效率及其應用範圍。該研究為快速獲得可遺傳修飾標記的轉基因動物提供了新的方法；為基因功能研究提供了重要平臺，為動物疾病模型的製備、疾病發生機制的研究提供了新的途徑，也為多能性調控、基因印記等基礎科學問題提供了研究模型。該成果分別於2012年發表於Nature，於2014年發表於Cell Stem Cell。

　　(2) 再生醫學相關動物模型與細胞模型的建立 

　　周琪研究組利用CRISPR-Cas系統誘導大鼠的Tet1/Tet2/Tet3 基因敲除，實現了效率高達100%的雙等位基純合突變的單基因敲除，和接近60%高效率的三基因同時敲除大鼠，並且證明CRISPR-Cas系統引入的基因修飾可以通過生殖細胞傳遞到下一代。基於CRISPR/Cas技術的高效基因修飾，首次利用直接原核注射CRISPR/Cas一步直接產生vWF基因敲除豬模型，建立了p53雙等位基因突變猴等動物模型，為研究人類重大疾病的發生機制和藥物篩選提供了重要模型。 

　　(3) 揭示了m⁶A甲基化對細胞重編程的調控作用 

　　周琪研究組與中科院北京基因組研究所楊運桂課題組、中科院遺傳與發育生物學研究所王秀傑課題組合作，揭示了microRNA通過序列互補調控mRNA 甲基化修飾形成這一全新的作用機制，以及m⁶A修飾在促進體細胞重編程為多能性幹細胞中的重要作用，在解析m⁶A修飾形成的位點選擇機制、拓展microRNA的新功能和發現新的細胞重編程調控因素方面均取得了開創性的重要突破。相關研究論文作為封面文章發表在2015年3月5日的Cell Stem Cell上。

　　(4) 標準化、規模化的治療用種子細胞的獲得以及細胞治療的臨床前安全性、有效性評估 

　　周琪研究組承擔了北京幹細胞庫的建設任務，經過幾年的努力，幹細胞庫已經建設完畢，並符合GMP標準。目前幹細胞庫資源包括人胚胎幹細胞和小鼠胚胎幹細胞在內的多種細胞系資源，並獲得了我國首批通過國家認證的、無異源成分的人類臨床級胚胎幹細胞系與成體幹細胞系，具有重要的基礎研究與臨床應用價值。周琪研究組已經建立了臨床級別人胚胎幹細胞定向誘導分化平臺，可獲得臨床級細胞來源的神經細胞、心肌細胞、視網膜色素上皮細胞等多種類型的功能細胞。目前已利用標準細胞開展25例不孕症臨床研究，優化臨床方案；已啟動4例輻射導致肺纖維化臨床研究，驗證安全性並優化臨床方案。

　　二、 成果相關報導

　　1、 成功通過單倍體胚胎幹細胞獲得轉基因動物 

　　2012年9月30日，Nature 在線發表了中國科學院動物研究所周琪研究組和趙小陽研究組合作完成的一項研究工作，該研究首次實現了利用基因修飾的單倍體胚胎幹細胞而獲得健康成活的轉基因哺乳動物。

　　單倍體細胞及其發育而成的個體是研究隱性遺傳基因的理想模型。針對單倍體胚胎幹細胞進行基因操作可以將基因修飾直接遺傳給後代，從而避免了其他轉基因方法種系嵌合等方面的要求，可以極大提高基因修飾的效率極其應用範圍。但哺乳動物中除配子外並不存在天然單倍體細胞。儘管國內外的研究人員已經在哺乳動物單倍體胚胎幹細胞的建立方面取得了一定的成果，但在此工作前，尚未獲得通過單倍體胚胎幹細胞產生的健康成活的基因修飾動物。 

　　周琪研究組和趙小陽研究組於2009年底開始小鼠單倍體胚胎幹細胞的建立工作，經歷了長達2年的實驗摸索，終於在2011年8月獲得了由孤雄單倍體胚胎幹細胞與卵母細胞受精發育成的健康小鼠。其中10只動物至今仍健康存活，並可正常繁殖後代。同時，該團隊還將攜帶基因修飾的單倍體胚胎幹細胞與卵母細胞受精，獲得了28只由單倍體胚胎幹細胞「受精」發育而成的基因修飾小鼠，其中有8只存活至今，並已經繁殖出下一代。 

　　該研究為靈長類等大動物的基因功能研究及疾病模型的建立開闢了一條新的道路。目前，哺乳動物中除了大鼠與小鼠的胚胎幹細胞能夠作為遺傳修飾的載體外，其他物種，包括靈長類動物的胚胎幹細胞無法進行生殖系傳遞，從而嚴重限制了利用這些物種建立疾病模型的工作。周琪等科學家利用單倍體幹細胞既能維持單倍性，又具有無限擴增能力的特性，建立了利用單倍體幹細胞進行基因修飾並遺傳的技術體系。這一方法有望克服目前難以獲得能夠穩定遺傳的非嚙齒類基因修飾動物的難題，對藥物開發、疾病發生機制等研究工作將產生積極的促進作用。 

　　該研究同時為研究生殖與發育的調控機制提供了模型，並提示類似技術可能對於人類致病基因的篩查和通過輔助生殖技術進行基因修正提供新的途徑。 

　　該研究工作得到了科技部、中國科學院和國家自然科學基金委的資助。中科院遺傳發育所研究員王秀傑與東北農業大學教授劉忠華及其團隊成員參與了該項研究。 

 

成功通過單倍體胚胎幹細胞獲得轉基因動物 

　　2、 Cell Stem Cell雜誌發表單倍體幹細胞研究新成果 

　　周琪團隊在單倍體幹細胞的研究和應用方面取得重要突破，相關研究成果於2014年12月19日在線發表於Cell Stem Cell雜誌。單倍體胚胎幹細胞同時具有單倍體細胞和胚胎幹細胞的特性，由於其只含有一套染色體，不存在等位基因在基因功能上的補償作用，因此是研究隱性基因功能的理想模型。同時，其胚胎幹細胞的特性又可以將基因修飾直接遺傳給後代，從而避免了其他轉基因方法種系嵌合等方面的要求，可以極大提高基因修飾的效率及應用範圍。  

　　在最新發表的研究中，該團隊成功地建立了大鼠的單倍體胚胎幹細胞系，並證明大鼠單倍體胚胎幹細胞在長期培養過程中仍可維持單倍性和多能性。進一步研究證明針對大鼠單倍體胚胎幹細胞進行大規模隨機突變可以快速地建立涵蓋整個基因組的基因突變細胞庫，從而為大規模基因篩選提供了基礎。利用基因定點修飾技術CRISPR-Cas系統，可快速高效地在單倍體幹細胞上進行精確定位的基因修飾或敲除，並且處理後的細胞仍能維持單倍體和多能性狀態。尤為重要的是該工作證明了大鼠單倍體胚胎幹細胞同樣具有替代精子與卵母細胞「受精」並產生健康大鼠的能力。通過種系嵌合和替代精子進行卵胞質注射兩種途徑，該團隊都成功獲得了健康的攜帶基因修飾的大鼠，從而證明大鼠孤雄單倍體胚胎幹細胞可以將基因修飾快速地遺傳給後代，為研究基因功能提供了便利。  

　　周琪團隊之前曾先後在Nature 等雜誌報導建立有功能的小鼠孤雄與孤雌來源的單倍體胚胎幹細胞系，並證實這些幹細胞可以替代精子或卵子完成受精和胚胎發育，產生健康的小鼠，從而實現遺傳物質從細胞到個體水平上的傳遞。此次的研究成果首次從小鼠之外的哺乳動物中獲得了具有發育功能的單倍體胚胎幹細胞系，而且首次利用CRISPR-Cas技術完成對大鼠單倍體胚胎幹細胞的多基因敲除，為建立用於大規模基因篩選的純合的基因突變細胞庫打下基礎。鑑於大鼠在生理上比小鼠更類似與人類，這一工作將對人類疾病模型研發和開展基因功能研究起到重要的推動作用。  

　　該研究得到了中科院幹細胞與再生醫學戰略性科技先導專項、科技部重大科學研究計劃和國家自然科學基金委的支持。  

 

單倍體幹細胞技術及其應用 

　　3、 發現m⁶A修飾形成的分子機制和m⁶A在促進細胞重編程中的新功能 

　　真核生物的RNA分子上可發生100多種修飾，其中腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修飾 (N6-methyladenosine, m⁶A) 是高等生物mRNA上含量最為豐富的修飾。m⁶A修飾參與調控mRNA的剪接、運輸、穩定性和翻譯效率等。並且與肥胖和腫瘤等多種生理功能異常及疾病相關。但受到研究方法的限制，關於m⁶A修飾的研究長期進展緩慢。m⁶A修飾主要發生在 mRNA上RRACH序列中的腺嘌呤上，由RNA甲基轉移酶複合物METTL3/METTL14/WTAP催化形成，並可被去甲基化酶ALKBH5和FTO移除。但細胞內只有部分mRNA上RRACH序列中的腺嘌呤會產生m⁶A修飾，這種特定m⁶A修飾形成位點是如何確定的，以及m⁶A修飾是否影響細胞重編程尚屬未知。 

　　動物所周琪課題組與北京基因組所楊運桂課題組、遺傳發育所王秀傑課題組合作，整合各自在幹細胞、RNA修飾、高通量數據分析方面的研究優勢，繪製了小鼠胚胎幹細胞 (ESC)、誘導多能性幹細胞 (iPSC)、神經幹細胞 (NSC)和睪丸支持細胞 (SC) 轉錄組的m⁶A修飾圖譜，發現了m⁶A修飾在多能與分化的細胞系間的分布差異，和發生在一些決定細胞特異分化的RNA分子上的細胞類型特異的m⁶A修飾。研究發現m⁶A修飾區域富集的特徵序列具有與重要的調控非編碼RNA ¾ microRNA的種子區 (5』 2-8 nt) 序列互補配對的偏好性。多層次的細胞與分子生物學實驗證明，microRNA可以通過序列互補的方式，引起mRNA相應位點區域m⁶A修飾的產生。提高m⁶A修飾水平可以提高Oct4等關鍵多能性調控基因的表達量，促進小鼠成纖維細胞重編程為誘導多能性幹細胞 (iPS細胞)。該研究成果揭示了microRNA通過序列互補調控mRNA 甲基化修飾形成這一全新的作用機制，和m⁶A修飾在促進體細胞重編程為多能性幹細胞中的重要作用，在解析m⁶A修飾形成的位點選擇機制、拓展microRNA的新功能、發現新的細胞重編程調控因素方面均取得了開創性的重要突破。  

　　該研究結果於2015年2月12日在線發表在Cell Stem Cell 雜誌。王秀傑課題組的研究生陳同、楊運桂課題組的研究生郝亞娟、李苗苗和周琪課題組助理研究員張映博士為該論文的共同第一作者。該研究得到科技部重大研究計劃、中科院幹細胞與再生醫學戰略性先導專項、國家自然科學基金等項目的資助。

 

RNA m⁶A甲基化位點選擇機制及其在調控細胞重編程中的重要功能  

　　4、 大鼠基因敲除工作取得突破 

　　2013年8月8日，Nature Biotechnology 雜誌在線發表了動物所周琪領導的生殖工程研究組的研究論文Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems，該研究利用CRISPR-Cas技術首次在重要模式動物大鼠上實現了多基因同步敲除。

　　大鼠是生命科學與生物醫學研究中最為常用的模式動物之一。相比小鼠，大鼠在生理上與人更加接近，而且體型較大容易操作。然而由於大鼠基因操作技術的滯後，基因修飾大鼠在生物醫學等研究中的應用遠遠落後於基因修飾小鼠。CRISPR-Cas體系利用一段與靶序列相同的RNA來引導Cas核酸酶對特異靶向DNA進行識別和切割，容易構建並且容易進行多基因同時靶向識別。周琪團隊利用CRISPR-Cas系統誘導大鼠的Tet1/Tet2/Tet3 基因敲除，實現了效率高達100%的雙等位基純合突變的單基因敲除，和接近60% 高效率的三基因同時敲除大鼠，並且證明CRISPR-Cas系統引入的基因修飾可以通過生殖細胞傳遞到下一代。

　　這一技術突破使得在大鼠中進行高效快速的多基因敲除成為可能，對於推動利用大鼠進行基因功能研究和大鼠在生物醫學研究中的應用具有重要作用。

　　這項研究工作得到了科技部、中國科學院和國家自然科學基金委的資助。

　　5、 周琪實驗室利用CRISPR技術建立血管性血友病小型豬模型 

　　周琪團隊首次利用CRISPR/Cas9技術獲得了vWF基因敲除豬，從而建立了血管性血友病的小型豬模型，相關研究成果於2014年1月31號在線發表在Cell Research 雜誌上。  

　　豬是我國最重要的家畜品種，同時也是生物醫學研究中重要的模式動物。豬在心血管、胃腸道等多項生理特徵上比嚙齒類更接近人類，其器官大小與功能也與人十分接近，而且其產仔量高易繁殖。基於此，對豬進行精細的基因組修飾，從而建立用於研究豬類疫病或人類疾病的模型，對於畜牧生產和生物醫學研究都具有重要價值。

　　CRISPR/Cas9系統易於構建，能夠快速引發多基因位點的突變，已在大鼠、小鼠等動物中獲得成功，但尚未被應用在豬等經濟動物的研究中。該研究團隊通過直接向小型豬的受精卵中注射切割vWF基因的CRISPR-Cas系統，高效地獲得了存活的雙等位基因突變的小型豬，證實了CRISPR技術在大動物中的可應用性。相比傳統的先在體細胞中進行基因敲除，然後通過體細胞核移植獲得基因敲除豬的「兩步法」，基於CRISPR高效性和便捷性的直接注射「一步法」能夠更加快速和方便的獲得基因敲除豬。vWF的突變會導致臨床上的I型和III型血管性血友病。該研究進一步發現這些基因敲除豬具有與血管性血友病患者相似的臨床表型——嚴重的凝血功能障礙。這也是首次報導利用CRISPR技術製備出具有特定疾病表型的哺乳動物疾病模型。該研究為利用豬為對象快速建立基因修飾的動物模型提供了新的途徑，將對家畜疫病與人類疾病的發病機理與治療方法研究起到較大的推動作用。

　　該研究得到了中科院幹細胞與再生醫學戰略性科技先導專項、科技部重大科學研究計劃和國家自然科學基金委的支持。

 

豬是我國最重要的家畜品種，同時也是生物醫學研究中重要的模式動物 

　　6、發現判斷幹細胞多能性的分子標準 

　　2010年6月18日出版的科學雜誌Journal of Biological Chemistry（JBC）以封面文章刊發了動物所周琪研究組和遺傳發育所王秀傑研究組合作取得的研究成果。此項研究首次發現了可以用來判斷小鼠幹細胞多能性水平的關鍵基因決定簇，對於幹細胞多能性水平決定機理的研究和幹細胞的臨床應用具有重要的促進作用。

　　胚胎幹細胞（ES）及誘導性多能幹細胞（iPS）技術是近年來生命科學研究領域的持續熱點，對揭示細胞重編程機制、研究個體發育以及再生醫學的臨床應用等都具有重要價值。2009年動物所周琪研究組率先證實了iPS細胞具有與胚胎幹細胞相似的全能性，但同時亦發現獲得具有完全多能性水平的 iPS 細胞的效率極低，多數 iPS 細胞由於重編程不完全而導致無法獲得後代或後代具有生理缺陷等問題，成為其在再生醫學中應用的一個巨大障礙。尤其是人類幹細胞系由於倫理學的限制，不能通過發育能力進行鑑定，更加難以確定其多能性水平。因此，如何準確地判斷幹細胞的多能性狀態並對其進行精確分型是幹細胞的基礎研究和轉化應用過程中一個急需解決的問題。

　　利用長期積累的大量具有不同發育潛能的小鼠 ES 和 iPS 細胞系，周琪與王秀傑的研究組合作，系統地分析了這些細胞的編碼基因、小分子RNA 和蛋白質表達譜，發現了一組在胚胎幹細胞和具有完全多能性的 iPS 細胞中高表達，在僅具有部分多能性的iPS細胞中不表達或表達水平極低的一個關鍵基因組區域。通過多種細胞系證明，位於這個區域內基因與 microRNA 簇的表達與細胞多能性狀態和發育潛能呈正相關，因此可以用來作為判斷幹細胞和iPS細胞多能性水平的分子標記。

　　此發現於2010年4月9日在JBC 在線發表後，即受到國際同行的普遍關注。美國生物化學與分子生物學協會對此成果發表了專題報導，並被ScienceDaily 等數十家國外媒體轉載。由於在小鼠基因組中沒有篩選出其他具有類似特性的基因簇，並且這一區域中的基因和 microRNA 簇在哺乳動物中高度保守，因此，若此區域在人類幹細胞中具有同樣的功能，則可作為判斷人的 ES 與 iPS 細胞系多能性水平的標準，將大大推動人類幹細胞的機理及臨床應用的研究進程。

　　此工作在JBC 在線發表後不久，Nature 雜誌上也在線刊發了美國科學家Konrad Hochedlinger 研究組的研究工作，他們在小鼠基因組的同一區域獲得了與此成果一致的結論，進一步證明了此成果的正確性和科學意義。 

 

Journal of Biological Chemistry 2010年6月18日第285期雜誌封面 

　　  

　　7、 從混沌到有序:揭示哺乳動物早期胚胎命運決定新機理 

　　動物所的合作團隊結合數學建模以及哺乳動物早期胚胎單細胞轉錄組測序數據分析，對哺乳動物早期胚胎第一次譜系分化的起源問題提出了新的解釋，研究工作發表於Development。

　　傳統觀點認為，哺乳動物早期胚胎的第一次細胞命運決定起始於桑葚胚階段（16細胞期），此階段的卵裂球首次在位置上出現了不對稱分布：定位到桑葚胚表面或內部的細胞將在隨後的發育中走向不同的細胞命運，「內」細胞分化為內細胞團（ICM，隨後發育為胎兒）；而「外」細胞分化為滋養外胚層（TE，隨後發育為胎盤）。然而，近年來的一些證據表明，哺乳動物早期胚胎在出現形態上的不對稱分布之前，早在4-8細胞期就已經出現了分子水平上的不對稱，並認為不同卵裂球之間分子水平的不對稱分布是決定卵裂球向ICM 或 TE分化的關鍵。然而，卵裂球之間的分子差異最早從何而來？卵裂球之間最初在分子水平產生的差別如何在後續分裂中如何動態變化並驅動不同的細胞命運決定？這些均是領域內尚未解答的問題。

　　藉助近年來快速發展的單細胞測序技術，動物所研究團隊通過對小鼠和人類從受精卵到16細胞期每個卵裂球的單細胞測序數據進行深度分析後發現：第一次卵裂後，兩個卵裂球的表達譜就出現差異；由於此時合子基因組轉錄還未開始，這種差異源於分裂時細胞內物質分配的隨機性。與這種隨機性相吻合的是，那些對細胞生存必不可少的因子，由於含量高，比較容易被均勻分配；相反表達量低的因子（往往對細胞命運起調控作用），很難得到均勻分配，導致在兩個卵裂球中含量出現差異。

　　伴隨著2細胞後期合子基因組轉錄啟動，這種卵裂球之間的隨機差異出現了兩種趨勢：一些分子趨向於消除在各個卵裂球之間的差異，符合數學上的「單穩模式」；而另一些分子在各個卵裂球之間的差異越來越大，出現兩極分化甚至「全或無」的分布，符合數學上的「雙穩模式」。有意思的是，符合「雙穩模式」的分子往往與細胞分化相關，提示這些分子及其形成的「雙穩模式」是引導早期卵裂球出現命運分化的關鍵。

　　進一步分析發現，具有相反作用的譜系決定因子，例如Carm1 (決定ICM) 和Cdx2 (決定TE)，在8細胞時期（形態上無明顯區別）已經在不同的卵裂球內形成了各自的優勢比例。這在分子層面已經預示了各個卵裂球後續不同的分化潛能。

　　該研究從分子水平揭示了早在卵裂球產生形態學差異之前，哺乳動物早期胚胎出現對稱破缺（symmetry breaking）的動態進程。文章指出最初的不均等分布起源於卵裂產生的分子隨機事件，繼而通過轉錄調控將卵裂球之間的差異放大，而作用相反的譜系決定因子間力量博弈的勝負介導了第一次細胞命運決定。這些結果為理解哺乳動物早期胚胎第一次細胞命運決定的分子機理提供了一個新的理論框架。

　　該課題主要由動物所段恩奎、周琪以及陶毅3個研究組合作完成，北京大學教授喬傑和湯富酬合作參與了該項工作。該工作得中國科學院、科技部以及國家基金的支持。

 

不同卵裂球之間關鍵因子的隨機差異分布與轉錄調控反饋共同驅動了哺乳動物早期胚胎第一次命運決定

    相關成果報導：1、動物所成功通過單倍體胚胎幹細胞獲得轉基因動物

                  2、動物所單倍體幹細胞研究取得新成果

                  3、科學家發現m6A修飾形成的分子機制及其在促進細胞重編程中的新功能

                  4、動物所大鼠基因敲除工作取得突破

                  5、動物所利用CRISPR技術建立血管性血友病小型豬模型

                  6、動物所與遺傳發育所聯合發現判斷幹細胞多能性的分子標準

                  7、動物所合作研究揭示哺乳動物早期胚胎命運決定的新機理