35年,聚合酶鏈式反應的歷史和展望|Science職業·生命專題

自從聚合酶鏈式反應（PCR）發明到現在（本文刊登時間為2018年5月），已經過去了35年。

PCR已經成為生物實驗室裡的一種常規技術，但是科研人員仍然在不斷推陳出新，為它尋找一些突破口，甚至是挽救生命的應用。

1983年5月，當時還在加州埃默裡維爾的Cetus公司擔任研發人員的Kary Mullis合成了一些寡核酸片段，隨後將它們與少量的模板DNA混合，並加入一種聚合酶及其他試劑。經過一系列的孵育後，正如Mullis所願，聚合酶已經通過一個鏈式反應將模板複製了許多次。

Mullis最終脫離了科學主流，Cetus經歷了一系列併購，但PCR依然存在。就像它靶向的DNA模板不斷擴展，PCR技術已經被複製、擴增並傳播到世界各地的實驗室。專用的熱循環儀和相關工具席捲市場，供應商出售各種各樣的熱穩定聚合酶，世界各地的大學生在生物學入門課程中學習這項技術。PCR已經有35年的歷史了，它已經成為一種無處不在的實驗室工具。儘管如此，研究人員、工程師和醫生仍在努力尋找將其推向新領域的方法。從這些努力中的一些案例上可以看出，PCR的應用範圍已經擴大到空前的程度，從奶牛場到診所，從教室到外太空。PCR所需的主要硬體是熱循環儀，這是一種能夠快速加熱和冷卻樣品管的機器，並能在特定的時間內將樣品管保持在精確的溫度。儘管三十年的發展和競爭極大地改進了這些機器，但它們仍然相對笨重、耗電和昂貴。因此，作為現代分子生物學的一項關鍵性技術，PCR仍然無法為一些教育工作者所使用，在許多偏遠地區也無法使用。「PCR是最重要的研究技術之一，但因為設備的規模和成本，它也是最受限制的技術之一。尤其當你在實驗室之外時，」位於麻薩諸塞州坎布裡奇的MiniPCR公司的遺傳學專家和共同創始人Zeke Alvarez-Saavedra這樣說。傳統的PCR儀不便移動，出於對這一特點的失望，2013年，Alvarez-Saavedra與分子神經生物學專家Sebastian Kraves合作，研製了一種可攜式熱循環儀。大多數熱循環儀使用Peltier結來控制溫度，Peltier結是一種能夠在加熱和冷卻之間快速切換的熱電裝置。不幸的是，Peltier結效率低下，操作這些結點所需的元件使熱循環儀變得笨重且耗電量大。Alvarez-Saavedra和Kraves採用了不同的方法，他們使用一種薄膜電阻加熱器加熱樣品，類似於汽車上常見的車窗除霜器。為了冷卻，團隊使用了一個簡單的風扇。微控制器驅動加熱、冷卻和孵育周期。更簡單的設計使得機器比普通的熱循環儀更小更輕，也帶來了其他好處。「當你把東西做的更小，它的零件更少，且耗電更少……這有助於降低成本，」 Alvarez-Saavedra說。正如他們所希望的，低成本的小型PCR系統立即吸引了學校客戶。Kraves說：「在我們成為科研人員的過程中，直到讀完高中還沒有接觸過生物技術，這對我們來說是一種痛苦，所以我們想要消除一些障礙。」公司還開發了一種小型、簡單的瓊脂糖凝膠電泳系統作為配套產品。一個包含熱循環儀、凝膠系統和配件的完整的工具包只賣不到1000美元，將它控制在了許多學校的預算之內。儘管學校已經成為MiniPCR的主要市場，其他行業也迅速採用了這一平臺。Kraves說，野外研究人員、動物育種專家和食品公司都逐漸採用了這個系統，他們發現，在現場進行自己的PCR檢測，要比把樣品送到遠程實驗室更便宜，也更快捷。然而，最令人驚訝的電話來自國際空間站上的工程師。「我們從來沒有專門要把這項技術設計成太空友好型的，所以當太空機構告訴我們它非常適合太空飛行時，我們感到特別驚訝，」 Kraves說。MiniPCR系統現在是競賽「太空中的基因」的核心組成部分，中學生們提出基於PCR的實驗，然後由空間站上的太空人在微重力環境下進行。MiniPCR是第一家將PCR應用於太空的公司，但他們並不是唯一一家試圖使這項技術更便宜、更便攜的公司。韓國首爾的Ahram Biosystems在銷售的Palm PCR微型化熱循環儀，類似於MiniPCR裝置。與此同時，位於賓夕法尼亞州費城的Biomeme公司將可攜式PCR的理念提升到了一個新的高度，將其擴展到實時PCR。在實時或定量PCR（qPCR）中，實驗人員使用螢光標記物連續監測PCR擴增的進展。通過測量新的DNA拷貝出現的速率，研究人員可以計算出初始樣本中有多少模板分子。他們也可以直接從PCR反應管中讀取結果，而不需要瓊脂糖凝膠電泳。然而，所有這些監測和計算都需要大量的計算能力和額外的設備，使得qPCR比標準PCR更加複雜和昂貴。Biomeme公司的聯合創始人Marc DeJohn、Jesse van Westrienen和Max Perelman認為，一種不相關的趨勢可能有助於讓qPCR走出實驗室。van Westrienen說：「我們想到，每個人口袋裡都有一部智慧型手機，但卻從沒見過他們用它來做分子診斷。」在解決與MiniPCR公司同樣面臨的熱循環儀工程問題時，Biomeme公司還解決了通過智慧型手機應用程式添加光學傳感器的難題，該應用程式既可以控制和監控qPCR反應，也可以用於對樣品製備所需的耐貯存試劑的管理。對於現場使用來說，「準備樣本可以說是最困難的事情，我們從一開始就致力於開發一種非常簡單的產品，不需要任何專業知識或特殊的實驗室設備。」van Westrienen這樣介紹。結果是一個針對不同應用的試劑盒目錄，每個試劑盒都有凍幹試劑和在樣管中預先測量的引物。Perelman說，通過使用該公司的相應試劑盒，一個受過最低限度培訓的實驗人員可以在幾分鐘內將一份原始樣品製備成一套qPCR反應樣品，為熱循環做好準備。這臺機器本身有一個與標準智慧型手機連接器兼容的基座。Biomeme公司基於網絡的數據埠可以存儲由此產生的原始數據，研究人員可以在線分析這些數據或將其下載到自己的電腦上。目前的Biomeme系統售價4000美元，比MiniPCR的系統貴很多，但是Perelman認為它提供了額外的功能：「你可以在一個小時內完成所有的工作，只需在應用程式中向左或向右滑動，就能實時看到擴增的效果。」Perelman還補充說，該公司目前正在與國防和執法部門的用戶，以及野外作業科研人員和食品公司合作。雖然可攜式PCR技術正在迅速擴大其應用範圍，但世界各地的研究人員仍在以無數漸進的方式推進其能力的拓展。區分活細菌和死細菌的問題為此提供了一個很好的例子。
 PCR對於檢測核酸序列是非常敏感和特異的，但是僅僅知道一個特定的DNA或RNA序列存在，並不能證明它與一個活的生物體有關。這是食品工業的一個主要問題，是否巴氏滅菌的食品中都會通過PCR檢測出病原菌陽性，儘管前者的細菌是安全的死亡的，而後者的細菌是危險的存活的。因此，食品實驗室長期以來依賴於相對緩慢、繁瑣的培養試驗來進行最終檢測。開發出只能進入死細菌的DNA交聯劑是該領域的第一個重大進展。交聯可以防止死細菌的DNA在隨後的PCR反應中被擴增。第一代試劑使用很不方便，需要暗室和冷庫。最近，日本奈川縣森永乳業的Takashi Soejima和他的同事開發出了一種穩定、耐光的化合物，同樣以死細菌為目標。該團隊最近的工作涉及鈀基試劑，這些試劑選擇性地幹擾了來自死亡而非活細菌的DNA通過PCR擴增。將鈀試劑與qPCR相結合，產生了一種可以取代舊的、更昂貴的技術，簡化了乳製品和其他食品設施生產的測試方法(1)。研究人員和設備製造商也借鑑其他領域的技術，對PCR進行了更徹底的修改。其中一項成果是液滴數字PCR（ddPCR），它結合了螢光活化細胞分類技術（FACS）和傳統PCR的各個方面。雖然ddPCR的實驗流程有些複雜，但它已經變得高度自動化。事實上，加州赫拉克勒斯的伯樂公司現在可以銷售完整的ddPCR設備，可以自動運行整個過程。在這些系統中，噴霧器將製備好的PCR反應混合液分離成數千個納米級的液滴，然後在熱循環過程中保持液滴的獨立。每個液滴都進行自己的一系列擴增，然後機器用螢光標記對其進行分類，以檢測目標序列。ddPCR已被證明特別適用於檢測背景水平（非靶標DNA）非常高的樣本中的微量靶標，如在患者血液樣本中循環的腫瘤DNA標誌物。這項技術已經相當穩定。至少，位於科羅拉多州博爾德的Biodesix公司，現在已經提供基於ddPCR的「液體活檢」臨床測試。Biodesix測試使用一個小血樣，可以快速識別肺癌患者腫瘤中的精確突變，讓醫生能夠為該腫瘤類型選擇最有效的藥物。「一旦我們知道了確切的突變，就可能藉助靶向療法來治療，這改變了我們治療病人的整個模式，」位於北卡羅萊納州格林維爾的東卡羅萊納大學臨床腫瘤學教授Mark Bowling說（他是該校的保羅.R.和凱薩琳. M.赫廷格·沃克傑出教授）。雖然傳統的活檢分析和測序可以得到相同的信息，但Biodesix測試要快得多。「我們可以在三天內得到測試結果，」Bowling說。標準的活檢可能需要兩周以上的時間。Bowling說，對於那些能對靶向治療產生響應的腫瘤患者來說，可能是生與死的區別。由於Biodesix是基於PCR技術，因此隨著製藥商推出更多的基因靶向療法，Biodesix測試的應用範圍還有擴大的空間。然而Bowling說，即使目前靶向化療藥物的選擇有限，知道病人確切的腫瘤類型，在三分之一的情況下已經改變了他們團隊的治療策略。臨床試驗一直是PCR開發人員關注的重點，但有時這種技術的要求阻礙了它的發展。在第一份描述Mullis版本PCR技術原理驗證的出版物上，作者展示了如何使用它來識別導致鐮刀型細胞特徵的血紅蛋白突變(2)。不幸的是，鐮刀型細胞貧血症流行的地區在撒哈拉以南的非洲，對於那裡的許多臨床實驗室來說，PCR仍然過於昂貴。即使PCR技術不斷拓展到新的領域，總有些限制促使大量研究人員開發替代它的核酸擴增技術。這些方法中的大部分都遵循類似的原理，但具備了不同的優勢。利用一種高速率聚合酶的多重置換擴增，已成為基因組測序的標準技術。而滾圈擴增則能夠將目標序列反覆複製到一條單鏈DNA上，在生物化學中得到了廣泛的應用。與此同時，環介導的等溫擴增技術（LAMP）已經成為想要在野外環境裡進行DNA測試的研究人員的熱門選擇。顧名思義，LAMP使用一種可以在恆定溫度下打開並重複複製DNA分子的聚合酶，因此無需昂貴的熱循環儀。這對像比利時列日的LaCAR MDx  Technologies這樣的公司很有吸引力。該公司正試圖開發適用於欠發達國家的臨床檢測技術。「我們就是在尋找一種使分子遺傳學檢測更容易的方法。你可以使用一些色譜柱或者PCR設備，但是你需要昂貴的材料和複雜的技術。」 LaCAR的執行長Arnaud Allaer說。該公司轉而開始採用LAMP技術，並很快發現它非常強大。除了不使用熱循環儀，該公司基於LAMP的檢測方法還可以鑑定來自新鮮或凍存血液樣本中的基因點突變，甚至是吸墨紙上的幹血斑，而不需要DNA提取步驟。終於實現了最初PCR論文的承諾，LaCAR根據他們的發現開發了一種廉價、可靠的鐮刀型細胞特性測試方法。Allaer說:「我們在列日大學做了一個臨床試驗，我們也將在剛果做一個。」（3）無論他們是在製造可攜式熱循環儀，使用先進的PCR檢測技術快速診斷癌症，還是探索其他技術來突破PCR的局限性，該領域的專家都對未來35年的DNA擴增技術發展持樂觀態度。「這是一個激動人心的時代，」Bowling說。

1. T. Soejima, K. Iwatsuki, Appl. Environ. Microbiol. 82,6930-6941 (2016).2. R. K. Saiki et al., Science 230, 1350-1354 (1985).3. L. Detemmerman, S. Olivier, V. Bours, F. Boemer,Hematology 23, 181-186 (2018).

Alan Dove是常駐麻薩諸塞州的科學作家和編輯。

致謝：本文中文翻譯內容來自《科學新聞》，譯者李楠，中國科學院深圳先進技術研究院的副研究員。

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