對蝦微孢子蟲聚合酶鏈式反應(PCR)檢測技術的發展

對蝦微孢子蟲聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術的發展

2016-05-10 23:06:00　　水產養殖網　　出處：曾氏悟語        瀏覽量： 6401 次 我要評論

近年來，我國沿海養殖業受微孢子蟲病困擾，已從東南亞向海南，繼而向大陸發展，形式不容樂觀。這是我去年10月翻譯的一篇來自美國學者的論文，該論文發表於2015年7月。希望能給養殖戶帶來參考價值。

總結：本文講到的微孢子蟲（EHP）是2006年甚至以前就發現了，起源於東南亞，有蔓延的趨勢，感染後無明顯臨床症狀，只能依靠聚合酶鏈式反應（PCR）分子生物學的方法檢測，可檢測出對蝦組織（主要存在於肝胰腺組織中）、排洩物（糞便）和水體中的EHP。但這一技術還不成熟。所以很難判斷是否感染了EHP。建議使用活飼料，注重養殖池的環境。本文主要講述PCR技術檢測EHP的方法，以及檢測到的EHP的形態特徵。

根據越南境內的魚塘數據（蝦農個人提供的數據）：把感染後的蝦苗放入蝦塘後的前25天時間內，對蝦生長速度正常，之後，對蝦的健康狀況開始惡化；受感染的對蝦飼料進食量減少（50-70%），肝胰臟變色。對蝦每天的死亡率約為1-2%。發現，在某些情況下，EHP通常伴有弧菌機會性感染（也稱為感染性肝胰腺壞死），這可能會導致增加對蝦死亡率。

譯文（節選）（原文就不提供了）：

微孢子蟲
聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術的發展

來源：美國，亞利桑那州85721，亞利桑那大學，動物與比較生物化學學院，水產養殖病理學實驗室；
越南，胡志明市，農林大學，漁業學院，水產養殖病理學系
發表於2015年7月3日

關鍵詞：蝦病，對蝦腸孢子蟲，微孢子蟲，原位雜交，聚合酶鏈式反應

摘要：

對蝦腸孢子蟲（縮寫為EHP），是一種微孢子蟲寄生蟲，寄生在對蝦體內的新興病菌。在亞洲的一些對蝦養殖國家中都已經出現了EHP，包括越南，泰國，馬來西亞，印度尼西亞和中國。據報導，EHP造成了養殖蝦的生長延遲。我們對越南和汶萊的感染對蝦的組織結構進行了檢測，發現性嗜鹼性包涵體存在於肝胰腺腎小管上皮細胞中。在腎小管上皮細胞中，我們發現從原質團到成熟的孢子的不同發展階段中都存在有EHP。通過對18srRNA進行PCR技術鑑定，EHP的一條長1.1kb的18srRNA基因片段被放大檢測，結果證明這一序列與泰國和中國對蝦中的EHP序列相吻合。我們複製了這一片段，將digoxigenin-11dUTP標記複製片段，並與凡納對蝦（越南）和紅額角對蝦（汶萊）的組織切片進行原位雜交。原位雜交的結果顯示，探針僅對細胞質內含物中的EHP感應，而對類似匹裡蟲的感染棉蝦病的微孢子蟲沒有感應。隨後，我們對18srRNA基因區域做了進一步的PCR檢測，結果顯示探針對其他兩種寄生病菌，一種變形蟲和棉蝦病微孢子蟲的EHP沒有感應，對不同甲克類動物，包括多毛類動物，魷魚，螃蟹和磷蝦的基因組DNA的EHP也沒有感應。我們從感染過的蝦槽中取樣，通過PCR技術鑑定，在樣本的肝胰腺組織，排洩物和水中檢測到了EHP。

簡介：

據報導，東南亞的海產蝦養殖場的庫存量嚴重影響了對蝦的數量增長，人們發現被感染池塘裡的對蝦都感染了微孢子蟲，對蝦腸孢子蟲(EHP)(Tourtip&nbspet&nbspal.,2009;Sritunyalucksana&nbspet&nbspal.,2014),一種寄生在對蝦體內的寄生蟲。在黑虎蝦斑節對蝦和南美白對蝦凡納對蝦也感染了EHP病菌。EHP感染給經濟帶來了巨大的損失，目前人們認為EHP是對蝦養殖業的重大威脅。儘管EHP對對蝦養殖場的影響非常大，但是在過去的兩年裡，由於惡性的病菌性疾病，急性肝胰腺壞死（AHPND,也被稱為早期死亡綜合症，EMS）引起的死亡數給養殖場又蒙上了一層陰影。儘管蝦農們通過提高檢測技術和養殖場管理來盡力降低病菌疾病的惡劣影響，EHP感染的亞致死現象還是很明顯。然而，AHPND流行的階段，EHP就很難被檢測出來；結果，這種病菌就在越南，中國，印度尼西亞，馬來西亞和泰國（Haet&nbspal.,2010）的養殖場中廣泛傳播。

感染EHP沒有明顯的臨床症狀，現在可以通過組織學檢查，原位雜交和PCR技術診斷出來（Tangprasittipap&nbspet&nbspal.,2013）。EHP是一種細胞內可以產生孢子的寄生蟲，它會在腎小管上皮細胞的細胞質區繁殖。研究組織感染的組織學揭露了這種寄生蟲的幾個發育階段，包括早期多核病原體和成熟孢子階段。這種病原體是多核的，成熟孢子是橢圓形的，長度是0.7-1.1微米。孢子包含一個單核，5-6圈極絲，一個後極泡，一根固定在極絲上的固著盤和一個高電子密度的壁(Tourtipet&nbspal.,2009)。

由於EHP在對蝦養殖場中非常普遍，所以有必要開發具體、高效的診斷方法來檢測病菌，發展管理策略。最後，我們應用PCR技術，放大EHP的18SrRNA基因，再用標記地可辛的探針探測原位雜交細胞中被感染的EHP，最後開發新的PCR技術探測對蝦組織，排洩物和水中的EHP。

2.材料和方法

2.1對蝦

2006年在汶萊收集了感染對蝦腸孢子蟲（EHP）的南美蘭對蝦。2014年和2015年在越南蝦塘裡收集了感染EHP的南美白對蝦。2014年，從泰國運送了一批南美蘭對蝦到我們亞利桑那大學的實驗室進行隔離檢測，這些對蝦後來被檢測出感染了EHP，它們的肝胰腺，排洩物和水進行了PCR技術取樣檢測。

為了檢測原位雜交（ISH），並通過PCR技術分析EHP的特異性，研究人員使用了具有棉蝦病臨床症狀的斑節對蝦樣本，這些對蝦來自2005年（固定組織）和2006年（冰凍組織）的馬達加斯加。還使用了感染了鱷組織變形蟲的南美白對蝦，這些蝦是在2014年收集到的。通過PCR技術分析，肝胰腺組織或者整隻對蝦被保護在95%的酒精當中或被風乾後送往我們實驗室。通過原位雜交技術，用戴維森固定法將蝦固定。

2.2.DNA提取

從感染EHP的對蝦中去除肝胰腺，（4-5隻蝦）放進一個樣本中。裝運感染EHP的對蝦的蝦槽中對排洩物和水進行了取樣。利用MicrosepAdvance離心裝置（PALL公司）將蝦槽裡的水濃縮150倍，用於DNA提取。用一種高純度DNA模板製備工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell&nbspLEV&nbspDNA純化試劑盒（Promega）。

為了測試EHP引物的特異性，PCR擴增檢測兩種寄生蟲病中的DNA：
（1）棉蝦病，2006年從馬達加斯加收集了斑節對蝦，這些蝦的肌肉變白，通過rRNA基因測序，發現它們的DNA呈陰性，因為內有類似於匹裡蟲的微孢子蟲（GenBankkp825331號）；
（2）變形蟲病，這些南美白對蝦大量死亡，通過組織學檢查，最後發現這些蝦感染了變形蟲（種類不確定）。

為了保證EHP引物沒有宿主基因組的反應，製備DNA模板：
（1）來自美國夏威夷的無特定病原（SPF）的南美白對蝦（>10樣本）、斑節對蝦（3個樣本）；
（2）來自沙烏地阿拉伯的印度對蝦（2個樣本）；
（3）在新喀裡多尼亞養殖的南美蘭對蝦（2個樣本）；
（4）來自菲律賓的羅氏沼蝦（2個樣本）；
（5）沙烏地阿拉伯附近蝦塘裡採集的蟹（7個樣本，未知的物種）；
（6）多毛類（3個樣本），滷蟲生物量（9個樣本），魷魚（2個樣本），磷蝦（2個樣本），這些是從各種商業供應商運送。

2.3.18S&nbsprRNA基因擴增和克隆

PCR檢測技術，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE醫療）。擴增18SrRNA基因的引物18S-F（5』-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA）和18S-R（5』-TCTGAAATAGTACGGGCGG）。PCR反應中包含200微米dNTP，0.2微米引物，10mM&nbspTris-HCl（pH9.0）,50毫米氯化鉀，1.5毫米氯化鎂，2.5U&nbspTaq&nbspDNA聚合酶和1微升提取的DNA（10納克至100納克每微升）。放大進行下列循環參數：到達94°C進行初始化3分鐘，然後94°C溫度下進行30秒，55°C溫度下進行30秒，72°C溫度下進行1分鐘，做35個此循環周期，並在最後一個周期停留在72°C溫度下5分鐘。在一個含有溴化乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分析PCR產物。在〜1KB一帶切除和提取DNA，克隆到pGEM-T-easy載體（Promega）上，命名為克隆pEHP-1。通過DNA測序，克隆的插入為1146bp（GenBankNo.kp759285）。國家生物技術信息中心（NCBI）使用BLAST序列資料庫對GenBank的相似序列進行了搜索。

2.4、探針標記和原位雜交

克隆pEHP-1質粒DNA被用來做成原位雜交時的一個探針。Mari等人描述，在PCR反應中，使用了digoxigenin-11-dutp（Roche）標記的基因探針（1998）。用於標記反應的引物EHP-F（5』-GGGAACGACGAACGGCTCAG）和EHP-R1（5』-TGCCTTGATGAGACACTGTT）產生一個1.1&nbspkb的片段。digoxigenin標記的DNA探針，用乙醇沉澱，懸浮在水中，並存儲在-20°C。棉蝦病，感染了類似於匹裡蟲的微孢子蟲的探針如微孢子蟲，是從一個克隆的16SRNA基因區域產生。

戴維森的AFA固定蝦進行了處理，石蠟包埋，按照標準方法切片（4微米厚）（萊特納，1996）。經過脫蠟，水化，蛋白酶K消化，和後固定，切片浸泡在用500微升的雜交液中（4×SSC，50%甲醯胺，1×登哈特的溶液，5%硫酸葡聚糖，0.5微克/毫升鮭魚精DNA），這種雜交液中含有EHP探針含（0.2μg/ml）。切片放在90°C加熱表面上10min，然後在42°C溫度下進行一夜的雜交。最終採用硝基藍四氮唑，5-溴-4-磷酸進行檢測抗地高辛抗體共軛鹼性磷酸酶（羅氏）。

2.5.EHP的PCR檢測。

PCR檢測技術，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE醫療）。探測EHP的引物是EHP-510F(5』-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT)和EHP-510R(5』-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA)。放大進行下列循環參數：到達94°C進行初始化3分鐘，然後94°C溫度下進行30秒，60°C溫度下進行30秒，72°C溫度下進行30秒，做35個此循環周期，並在最後一個周期停留在72°C溫度下5分鐘。

3.結論與討論

3.1臨床症狀與EHP感染史

目前，養殖對蝦過程中所發生的EHP感染還沒有特定的的臨床症狀。EHP感染通常與發育不良和死亡率上升有關。根據越南境內的魚塘數據（蝦農個人提供的數據）：把感染後的蝦苗放入蝦塘後的前25天時間內，對蝦生長速度正常，之後，對蝦的健康狀況開始惡化；受感染的對蝦飼料進食量減少（50-70%），肝胰臟變色。對蝦受到感染之後，其體型（即重量，每周進行一次稱重）僅為健康對蝦的10-40%。對蝦EHP感染死亡率並非一成不變，根據養殖場統計，對蝦每天的死亡率約為1¬2%。在實驗室測定過程中，對蝦EHP死亡率並無顯著上升，（Tangprasittipap，2013），由於測定持續周期較短（7天），有可能無法檢測出死亡率的大幅變化。情況較為嚴重的EHP感染可能會增加其他細菌感染的易感性。我們發現，在某些情況下，EHP通常伴有弧菌機會性感染（也稱為感染性肝胰腺壞死），這可能會導致增加對蝦死亡率。

本文從越南搜集了感染EHP的南美白對蝦作為組織學檢查樣品，結果，研究人員在其體內發現嗜鹼性包涵體，這種物質主要位於肝胰腺細管上皮細胞的胞漿內（圖1A）。這些夾雜物主要出現在瘧原蟲階段；此外，研究人員還發現了成熟的嗜鹼性孢子。

圖1是受感染對蝦的H&E組織圖（邁爾-貝內特蘇木精和曙紅螢光桃紅）以及EHP的原位雜交組織在。
（A）南美白對蝦經過H&肝胰腺組織染色後的狀態。箭頭表示成熟的孢子，星星表明瘧原蟲階段；
（B）EHP探針延續部分的原位雜交。深藍色沉澱物表明存在EHP。
（C）H&E&nbspP優化染色；
（D）EHP探針原位雜交。
（E）H&E對斑節對蝦體內匹裡蟲屬微孢子蟲引起的棉蝦病尾肌進行染色；
（F）與EHP探針進行原位雜交（插入照片F）：與匹裡蟲屬微孢子蟲進行原位雜交。
比例尺=25μm（讀者可以參考本文的網絡版本來了解圖例顏色的含義）。

3.2&nbspEHP18S核糖體核糖核酸（rRNA）的基因增殖與序列分析

研究人員從越南搜集受到EHP感染的對蝦，並且針對這些對蝦體內18SrRNA基因的聚合酶鏈式反應進行了研究。研究發現了A1146bp基因片段。同源性分析結果顯示對蝦體內96-100%的身份信息與來自中國和泰國的EHP18S&nbsprRNA基因相同（基因庫編號:KF362129，KF362130，FK496356，KP027539）；此外，對蝦體內93%的身份信息與細胞核內的微孢子蟲相同，87-88%身份信息與到其他微孢子蟲相同，其中包括Nucleosporacyclopteri和Enterocytozoonbieneusi，82-83%的身份信息與Enterscytosporaartemia相同。

3.3&nbspEHP原位雜交

人們主要養殖三種對蝦，其中包括南美白對蝦，細角對蝦和斑節對蝦。通過組織學研究與原位雜交研究，人們發現這三種對蝦都已感染EHP。（Tourtip，2009；Tangprasittipap，2013）。原位雜交更為敏感，適用於病原體檢測；如果無法通過組織學研究發現細胞的夾雜物或微孢子蟲，研究人員可以選擇原位雜交進行觀察。在研究過程中，克隆的18SrRNA基因片段被標記為地高辛，主要用作受到EHP感染的南美白對蝦的原位雜交探針。探針能夠對細胞質內的嗜鹼性夾雜物產生強烈反應（圖1B）。研究人員於2006年從汶萊搜集到的南美蘭對蝦樣本也表明肝胰腺內存在微孢子蟲孢子（圖1C），而腎小管上皮細胞可以在孢子中通過原位雜交的方式產生陽性反應（圖1D）。在以上兩種情況中，肝胰腺是唯一能夠接觸到EHP探針的組織。此外，H&E組織學研究中所發現的損傷與原位雜交的結果存在一定的關聯。南美白對蝦EHP感染樣本的研究結果與Tangprasittipap等人所描述的結果相似。（2013）。來自汶萊的EHP感染南美白對蝦樣本的診斷結果表明從汶萊也表明亞洲漁場從2006年，甚至2006年之前，就已出現EHP。

探針的應用範圍有限。針對那些無特定病原的對蝦（沒有相應數據），研究人員尚未發現探針與對蝦體內的任何組織產生反應。對於感染棉蝦病的斑節對蝦而言，其尾肌會出現匹裡蟲屬微孢子蟲，而這些微孢子蟲中的孢子呈嗜酸性。（圖1E）。研究人員決定採用EHP探針進行研究，但是在研究過程中，EHP探頭沒有對感染棉蝦病的斑節對蝦產生任何反應（圖1F）。

研究人員從患有棉蝦病的對蝦身上克隆出了被標記為地高辛的18SrRNA基因片段（1.1kb），該基因片段主要用於原位雜交。該探針可以探測病斑節對蝦是否患有棉蝦病（見插圖1F）。根據SSUrRNA基因系統發育（Stentiford，2013），18SrRNA基因片段中94%的身份信息與匹裡蟲屬相同，與Enterocytozoon屬差別較大。這也解釋了為什麼EHP探針沒有對患有棉蝦病的微孢子蟲產生交叉反應。

圖2，通過聚合酶鏈式反應檢測南美白對蝦肝胰腺組織，糞便以及生活水域中的對蝦腸孢子蟲。M：1KB分子量梯狀標記。對那些從越南搜集到的南美白對蝦進行聚合酶鏈式反應檢測（VN）（第1列為2014年樣本，第2列為2015年樣本）對那些從泰國搜集到的南美白對蝦進行聚合酶鏈式反應檢測（TH）（第3-5列分別代表肝，糞便和水）。對那些患有棉蝦病的斑節對蝦進行聚合酶鏈式反應檢測（第6列），對帶有變形蟲的南美白對蝦進行檢測（第7列），為無特定病原（SPF）的南美白對蝦進行檢測（第8列）。對2015年搜集到的滷蟲生物樣本進行檢測（第9列）。HP:肝胰腺。

3.4&nbspEHP聚合酶鏈式反應

研究人員從感染EHP的18SrRNA基因片段中選出EHP-510F/R引物，從感染EHP的對蝦中提取出基因，並且通過聚合酶鏈式反應的對其進行檢測。結果表明，聚合酶鏈式反應可以檢測出發生感染的南美白對蝦（圖2中第1列和第2列分別代表2014和2015年從越南搜集的對蝦，而第3列代表2014年從泰國搜集的對蝦）。那些從感染的蝦池中搜集的水樣和糞便同樣感染了EHP（圖2，第4列和第5列）。這些EHP引物沒有與感染棉蝦病的匹裡蟲屬微孢子蟲產生交叉反應（圖2，第6列），也沒有與感染的變形蟲產生反應（圖2，第7列）。

18SrRNA基因的引物沒有與南美白對蝦（圖2，第8列），斑節對蝦，對蝦，細角對蝦和羅氏沼蝦的基因組產生反應（數據未顯示）。在親蝦養殖過程中，對蝦通常食用多毛類生物，魷魚，以及滷蟲，這些微生物可能攜帶EHP，事實也正是如此，研究人員通常在這些微生物身上發現EHP。聚合酶鏈式反應的檢測結果表明EHP引物不會與多毛類生物，魷魚，以及滷蟲的基因產生反應。研究人員還測試了螃蟹的基因，這些螃蟹主要來自養蝦池。研究結果表明EHP引物沒有與甲殼類動物產生反應。

出乎意料的是，研究人員在9個滷蟲冷凍樣本中發現其中4個感染EHP。（圖2，第9列，代表性樣本）。從感染EHP的滷蟲中，研究人員對18SrRNA基因進行了擴增和測序。1.1kb基因片段中99.9%的身份信息與來自越南且感染EHP的樣本是相同的（2個核苷酸不同），這表明滷蟲攜帶的EHP可能源自東南亞。感染EHP的4個滷蟲樣品來自同一個私人供應商，這些滷蟲可以來自同一地點。EHP感染在對蝦養殖過程中可能會繼續發生。人們需要創建一個通過建立監督機制，從而控制這種寄生蟲並降低風險的有效手段。在這方面，人們可以採用敏感度較高的EHP分子檢測方法，此外，在對蝦養殖過程中使用活飼料，注重池塘環境也是非常重要的。養殖戶無法通過簡單的目測來判定感染EHP的對蝦，因為對蝦沒有明顯的臨床症狀。如果無法及時檢測出感染EHP感染的對蝦，那麼EHP可迅速蔓延。通過此次診斷，研究人員發現了基於原位雜交和聚合酶鏈式反應的檢測技術具有一定的敏感度而且適用於養蝦池，從而提供了有價值的常規診斷和監測工具，這種工具適用於池塘環境和水產養殖。

總結一下：本文講到的微孢子蟲（EHP）是2006年甚至以前就發現了，起源於東南亞，有蔓延的趨勢，感染後無明顯臨床症狀，只能依靠聚合酶鏈式反應（PCR）分子生物學的方法檢測，可檢測出對蝦組織（主要存在於肝胰腺組織中）、排洩物（糞便）和水體中的EHP。但這一技術還不成熟。所以很難判斷是否感染了EHP。建議使用活飼料，注重養殖池的環境。本文主要講述PCR技術檢測EHP的方法，以及檢測到的EHP的形態特徵。

根據越南境內的魚塘數據（蝦農個人提供的數據）：把感染後的蝦苗放入蝦塘後的前25天時間內，對蝦生長速度正常，之後，對蝦的健康狀況開始惡化；受感染的對蝦飼料進食量減少（50-70%），肝胰臟變色。對蝦每天的死亡率約為1¬2%。發現，在某些情況下，EHP通常伴有弧菌機會性感染（也稱為感染性肝胰腺壞死），這可能會導致增加對蝦死亡率。


翻譯：惠州市三寶生物化學科技有限公司&nbsp&nbsp曾燕

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