PCR技術

2020-11-25 生物谷

1 導論
多聚酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美國Perkin-Elmer/Cetus公司人類遺傳研究室Mullis K. B.等人於1985年發明的一種快速體外DNA片段擴增技術，是八十年代分子生物學資源領域的一項革命性突破，被譽為分子生物學資源發展史上的又一裡程碑。該技術一問世，就在分子生物學、醫學、生物工程、法醫學、考古學等領域得到快速而廣泛的應用，並且對已建立的基因克隆、DNA序列分析等現代分子生物學技術的發展也起了巨大的推動作用。
PCR技術是一種模擬自然DNA複製過程的體外酶促合成特異性核酸片段技術（亦稱無細胞分子克隆技術）。它以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸作為介導，通過DNA聚合酶促反應，在體外進行特異DNA序列擴增。其過程包括模板變性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在內的重複循環系列，使末端被引物5』端限定的特異性片段成指數形式累積。由於在每一循環中合成的引物延伸產物可作為下一循環中的模板，因而每次循環中靶DNA的拷貝數幾乎呈幾何級數增長。因此20次PCR循環將產生約一百萬倍（220）的擴增產物，具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強的特點，並且具有從DNA粗製品和降解的DNA模板中擴增靶序列的能力，這一點在生藥鑑定應用中尤為重要。
PCR的原理類似於DNA的天然複製過程，關鍵是運用兩個起始引物，分別為待擴增序列的相對的兩條單鏈DNA結合，結合位點分別位於待擴增序列的兩端，並且3』端相對，然後利用DNA聚合酶依賴於DNA模板的特性，模仿體內的複製，在兩個引物之間誘發聚合酶反應。PCR反應可以簡述如下：
在微量離心管中加入適量緩衝液，加微量模板DNA，四種脫氧單核苷酸（dNTP），耐熱Taq聚合酶及兩個合成DNA引物，並有Mg2 存在。
1、加熱使模板DNA在高溫下（95℃左右）變性，雙鏈DNA解開而變成單鏈DNA游離於溶液中。這是所謂變性階段。
2、PCR的引物是兩段人工合成的寡核苷酸鏈，長度為16－24個核苷酸殘基，其順序由被擴增的DNA片段兩端的序列決定。這兩段寡核苷酸鏈分別與模板DNA的正鏈和負鏈互補，所互補的位點一個在被擴增序列的「上遊」，一個在被擴增序列的「下遊」。高溫使模板DNA變性成單鏈以後，溫度降低，由於PCR反應體系中引物的拷貝數遠遠多於模板DNA的拷貝數，因而引物與模板DNA形成複合物的機率要大大高於模板DNA兩條單鏈的重新結合。只要嚴格地控制復性的條件，復性過程是傾向於形成引物與模板的複合物的。這是退火階段。
3、溶液反應溫度升至中溫（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP為原料，引物為複製起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之後延伸為兩條雙鏈。這是延伸階段。
如此重複，改變反應溫度，即高溫變性，低溫退火，中溫延伸三個階段。這三次改變溫度為一個循環。每循環一次，使特異區段基因拷貝數擴大一倍，一般30次循環，基因放大數可達2n倍。可用公式
Y＝（1＋X）n
表示，式中Y＝DNA擴增倍數，X＝擴增效率，循環數為n。
如X＝100%，n＝20時，Y＝1048576倍。但實際擴增效率（X）不會達到100%。

2 試驗條件
本程序適用於自動PCR操作，可適用於大多數情況，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩定聚合酶，如Taq聚合酶等。

【藥品試劑】
引物（各50pmol）
0.2mmol/L dNTPs（必須使用高質量的dNTPs，這一點非常重要。dNTPs經反覆化凍後會發生降解，因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等）
模板DNA：約0.05～1mg基因組DNA或0.002～0.02mg質粒DNA
Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR緩衝液（500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3）
礦物油
電泳所需試劑


【儀器設備】

PCR擴增儀
電泳裝置
微量離心機
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5ml Eppendorf管
紫外線觀察裝置及照相設備

2.2.2.3 操作程序

1．在無菌的Eppendorf管內加入以下反應物：


2．93℃反應2 min後開始以下循環：
93℃變性反應1 min；
50℃退火反應1 min；
72℃延伸反應3 min。
經過17～35循環後，最後一個循環72℃增加5 min。循環結束後反應產物置於40℃保存。
3．取1～5ml反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。

2.2.2.4 應注意的問題及其解決方法
1．PCR反應條件的優化
要優化特定的PCR反應，有必要試用不同的反應組分和循環參數。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進反應條件，提高PCR產量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個參數就行了，如pH值和MgCl2濃度。表2-2給出了循環參數對PCR結果的影響。
表2-1 PCR各反應組分濃度對產物特異性和產量的影響

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