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知識無國界，希望也不再用於套路

核磁共振譜能夠檢測、鑑定物質樣品的分子結構，在於譜圖反映了分子結構中原子的種類、原子（核）的數量多少、它與與之相連的其它原子的相互關係、等等。核磁共振波譜法已在很多實驗室被廣泛應用，今天咱們就聊一聊這個核磁共振譜的基礎知識。

核磁共振或簡稱NMR是一種用來研究物質的分子結構及物理特性的光譜學方法。核磁共振波譜法（Nuclear Magnetic Resonance，簡寫為NMR）與紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、質譜被人們稱為「四譜」，是對各種有機和無機物的成分、結構進行定性分析的最強有力的工具之一，亦可進行定量分析。核磁共振與紫外、紅外吸收光譜一樣都是微觀粒子吸收電磁波後在不同能級上的躍遷。紫外和紅外吸收光譜是分子分別吸收波長為200~400nm和2.5~25μm的輻射後，分別引起分子中電子的躍遷和原子振動能級的躍遷。而核磁共振波譜中是用波長很長（約106~109 μm，在射頻區）、頻率為兆赫數量級、能量很低的電磁波照射分子，這時不會引起分子的振動或轉動能級的躍遷，更不會引起電子能級的躍遷。但這種電磁波能與處在強磁場中的磁性原子核相互作用，引起磁性的原子核在外磁場中發生磁能級的共振躍遷，從而產生吸收信號。這種原子核對射頻電磁波輻射的吸收就稱為核磁共振波譜。NMR波譜按照測定對象分類可分為：1H-NMR譜（測定對象為氫原子核）、13C-NMR譜及氟譜、磷譜、氮譜等。有機化合物、高分子材料都主要由碳氫組成，所以在材料結構與性能研究中，以1H譜和13C譜應用最為廣泛。1、連續波核磁共振譜儀(CW-NMR)射頻振蕩器產生的射頻波按頻率大小有順序地連續照射樣品，可得到頻率譜；

2、脈衝傅立葉變換譜儀（PET-NMR）射頻振蕩器產生的射頻波以窄脈衝方式照射樣品，得到的時間譜經過傅立葉變換得出頻率譜。

連續波核磁共振譜儀由磁場、探頭、射頻發射單元、射頻、磁場掃描單元、 射頻檢測單元、數據處理儀器控制六個部分組成。

 頻率大的儀器，解析度好、靈敏度高、圖譜簡單易於分析。除了運用在醫學成像檢查方面，在分析化學和有機分子的結構研究及材料表徵中運用最多。

一般根據化學位移鑑定基團；由耦合分裂峰數、偶合常數確定基團聯結關係；根據各H峰積分面積定出各基團質子比。核磁共振譜可用於化學動力學方面的研究，如分子內旋轉，化學交換等，因為它們都影響核外化學環境的狀況，從而譜圖上都應有所反映。核磁共振成像技術已成功地用來探測材料內部的缺陷或損傷，研究擠塑或發泡材料，粘合劑作用，孔狀材料中孔徑分布等。可以被用來改進加工條件，提高製品的質量。

材料的組分比較多時，每種組分的 NMR 參數獨立存在，研究聚合物之間的相容性，兩個聚合物之間的相同性良好時，共混物的馳豫時間應為相同的，但相容性比較差時，則不同，利用固體 NMR 技術測定聚合物共混物的馳豫時間，判定其相容性，了解材料的結構穩定性及性能優異性。

此外，在研究聚合物還用於研究聚合反應機理、高聚物序列結構、未知高分子的定性鑑別、機械及物理性能分析等等。不同場強需要的樣品量不同，如300兆核磁、分子量是幾百的樣品，測氫譜大約需要2mg以上的樣品，測碳譜大約需要10mg以上。600兆核磁測氫譜大約需要幾百微克。

因為測試時溶劑中的氫也會出峰，溶劑的量遠遠大於樣品的量，溶劑峰會掩蓋樣品峰，所以用氘取代溶劑中的氫，氘的共振峰頻率和氫差別很大，氫譜中不會出現氘的峰，減少了溶劑的幹擾。在譜圖中出現的溶劑峰是氘的取代不完全的殘留氫的峰。另外，在測試時需要用氘峰進行鎖場。

由於氘代溶劑的品種不是很多，要根據樣品的極性選擇極性相似的溶劑，氘代溶劑的極性從小到大是這樣排列的：苯、氯仿、乙腈、丙酮、二甲亞碸、吡啶、甲醇、水。還要注意溶劑峰的化學位移，最好不要遮擋樣品峰。

測試樣品加TMS(四甲基矽烷)是作為定化學位移的標尺，也可以不加TMS而用溶劑峰作標尺。首先，確定孤立甲基及類型，以孤立甲基峰面積的積分高度，計算出氫分布；其次，是解析低場共振吸收峰（如醛基氫、羰基氫等），因這些氫易辨認，根據化學位移，確定歸屬；最後，解析譜圖上的高級偶合部分，根據偶合常數、峰分裂情況及峰型推測取代位置、結構異構、立體異構等二級結構信息。

一般先查看全去偶碳譜上譜線數與分子式中所含碳數是否相同？數目相同說明每個碳的化學環境都不同，分子無對稱性；數目不相同（少）說明有碳的化學環境相同，分子有對稱性；然後由偏共振譜，確定與碳偶合的氫數；最後由各碳的化學位移，確定碳的歸屬。

C譜和H譜可互相補充。H譜不能測定不含氫的官能團，如羰基和氰基等；對於含碳較多的有機物，如甾體化合物，常因烷氫的化學環境相似，而無法區別，這是氫譜的弱點；而碳譜彌補了氫譜的不足，它能給出各種含碳官能團的信息，幾乎可分辨每一個碳核，能給出豐富的碳骨架信息。但是普通碳譜的峰高常不與碳數成正比是其缺點，而氫譜峰面積的積分高度與氫數成正比，因此二者可互為補充。在網上有這樣一個求助帖：請教偶合常數的計算， 比如 ：—OCH2CH3 這兩個碳上的氫之間的化學位移差值一般超過2了，400M核磁，那再乘以400的話，偶合常數豈不是快一千了？

首先我們得搞明白偶合常數的定義：自旋偶合會產生共振峰的分裂後，兩裂分峰之間的距離（以Hz為單位）稱為偶合常數。不是兩組氫之間化學位移的差值，而是一組峰中相鄰兩個峰之間的化學位移的差值！

可以從偶合常數看出基團間的關係，鄰位偶合常數較大，遠程偶合常數較小。還可以利用Kapulus公式計算鄰位氫的二面角。對於有雙鍵的化合物，順式的氫之間偶合常數為6～10Hz，反式的氫之間偶合常數為12～16Hz。NMR（核磁共振波譜法）是研究原子核對射頻輻射的吸收，是對各種有機和無機物的成分、結構進行定性分析的最強有力的工具之一，有時亦可進行定量分析。核磁共振是有機化合物結構鑑定的一個重要手段,一般根據化學位移鑑定基團；由偶合分裂峰數、偶合常數確定基團聯結關係；根據各H峰積分面積定出各基團質子比。核磁共振譜可用於化學動力學方面的研究，如分子內旋轉，化學交換等。核磁共振還用於研究聚合反應機理和高聚物序列結構。二維核磁共振譜已經可以解析分子量較小的蛋白質分子的空間結構。核磁共振譜是有機化學家們心目中的「四大名譜」之一（包括：紫外光譜、紅外光譜和質譜）。H譜、C譜是應用量廣泛的核磁共振譜，較常用的還有F、P、N等核磁共振譜。一般先確定孤立甲基及類型，以孤立甲基峰面積的積分高度，計算出氫分布；其次是解析低場共振吸收峰（如醛基氫、羰基氫等），因這些氫易辨認，根據化學位移，確定歸屬；最後解析譜圖上的高級偶合部分，根據偶合常數、峰分裂情況及峰型推測取代位置、結構異構、立體異構等二級結構信息。一般先查看全去偶碳譜上譜線數與分子式中所含碳數是否相同？數目相同說明每個碳的化學環境都不同，分子無對稱性；數目不相同（少）說明有碳的化學環境相同，分子有對稱性；然後由偏共振譜，確定與碳偶合的氫數；最後由各碳的化學位移，確定碳的歸屬。C譜和H譜可互相補充。H譜不能測定不含氫的官能團，如羰基和氰基等；對於含碳較多的有機物，如甾體化合物，常因烷氫的化學環境相似，而無法區別，這是氫譜的弱點；而碳譜彌補了氫譜的不足，它能給出各種含碳官能團的信息，幾乎可分辨每一個碳核，能給出豐富的碳骨架信息。但是普通碳譜的峰高常不與碳數成正比是其缺點，而氫譜峰面積的積分高度與氫數成正比，因此二者可互為補充。其次，自旋量子數最好為1/2（自旋量子數大於1的原子核有電四極矩，峰很複雜）；第三，被測的元素（或其同位素）的自然豐度比較高（自然豐度低，靈敏度太低，測不出信號）。與O、S、N相連的氫是活潑氫，想要看到活潑氫一定選擇氘代氯仿或DMSO做溶劑。在DMSO中活潑氫的出峰位置要比CDCl3中偏低場些。活潑氫由於受氫鍵、濃度、溫度等因素的影響，化學位移值會在一定範圍內變化，有時分子內的氫鍵的作用會使峰型變得尖銳。為了確定活潑氫，要做重水交換。方法是：測完樣品的氫譜後，向樣品管中滴幾滴重水（不宜加入過多，一般1-2滴即可），振搖一下，再測氫譜，譜中的活潑氫就消失了。醛氫和醯胺類的氨基氫交換得很慢，需要長時間放置再測譜或者用電吹風加熱一下，放置一會再進行檢測。此時會發現譜圖中水峰信號增強，在CDCl3中此時的HDO峰會在4.8ppm的位置。此外，甲醇和三氟醋酸都有重水交換作用，看不到活潑氫的峰。8、解析合成化合物的譜、植物中提取化合物的譜和未知化合物的譜，思路有什麼不同？合成化合物的結果是已知的，只要用譜和結構對照就可以知道化合物和預定的結構是否一致。對於植物中提取化合物的譜，首先應看是哪一類化合物，然後用已知的文獻數據對照，看是否為已知物，如果文獻中沒有這個數據則繼續測DEPT譜和二維譜，推出結構。對於一個全未知的化合物，除測核磁共振外，還要結合質譜、紅外、紫外和元素分析，一步步推測結構。9、配製樣品為什麼要用氘代試劑？怎樣選擇氘代試劑？因為測試時溶劑中的氫也會出峰，溶劑的量遠遠大於樣品的量，溶劑峰會掩蓋樣品峰，所以用氘取代溶劑中的氫，氘的共振峰頻率和氫差別很大，氫譜中不會出現氘的峰，減少了溶劑的幹擾。在譜圖中出現的溶劑峰是氘的取代不完全的殘留氫的峰。另外，在測試時需要用氘峰進行鎖場。由於氘代溶劑的品種不是很多，要根據樣品的極性選擇極性相似的溶劑，氘代溶劑的極性從小到大是這樣排列的：苯、氯仿、乙腈、丙酮、二甲亞碸、吡啶、甲醇、水。還要注意溶劑峰的化學位移，最好不要遮擋樣品峰。

現在已經研究清楚、大量使用的核磁共振譜有：核磁共振氫譜、碳譜、氟譜、磷譜、氮-15(N-15)譜、氮-14譜、等等。用到核磁共振氫譜以確定有機化合物的含氫基團的類別的數量、每類含氫基團的氫原子個數比例、這些含氫基團的可能結構組成、同時能夠間接反映與這些含氫基團相連的-O-、-N-、-C=O、-COO-、等等的信息；在核磁共振氫譜、核磁共振碳譜的測定中，還有可利用的許多現代測定技術對樣品進行更深入的測試，如多脈衝譜、多維二維譜等等，以利於推導化合物的分子結構甚至幾何異構。

結構確證的方法多用多樣，但在當今有機合成人的眼裡，NMR依然是最重要、不可或缺的工具，小至有機合成的結構表徵，大至複雜天然產物的結構鑑定，可以說NMR就是有機合成人員的眼睛。然而，不同技術員NMR解譜水平參差不齊，不少人還停留在通過Chemdraw或Mestrenova的NMR預測功能來研判化合物結構的水平，結果可能會得出錯誤的結論。

2017年，加拿大魁北克大學Steven R. LaPlante教授在Bioorg. Med. Chem. Lett.發表了題為「NMR strategies to supportmedicinal chemistry workflows for primary structure determination」的文章，詳述了各種NMR技術在有機化合物結構解析中的應用策略，包括區分區域異構體和幾何異構體，區分N-烷基類似物和O-烷基類似物，鑑定旋轉異構體和阻轉異構體。

作者開篇先列舉了兩個藥物研發領域中結構表徵錯誤的例子：

第一個是Bosutinib的案例。2012年，C&EN發出警告Bosutinib錯誤的異構體（下圖1a）正在市面出售，而該異構體是沒有活性的。購買了該化合物的科學家可能實際上收到的不是真正的分子。當時，Bosutinib正處於治療慢性粒細胞白血病的III期臨床試驗中，同時也作為一種酪氨酸激酶抑制劑用於醫學和基礎研究。據Bosutinib供應商透露，銷售錯誤異構體的公司高達80%，當時，用SciFinder搜索bosutinib可產生300多個結果，可以說，全世界的研究工作可能因此而無效。以牛津大學為例，研究人員從購買的假Bosutinib的日期表明，至少從2006年以來，這種不正確的異構體一直在商業中使用，直到6年後才發現。最終調查結果是合成中使用了錯誤的苯胺原料，3,5-二氯-4-甲氧基苯胺（1c）代替了正確的2,4-二氯-5-甲氧基苯胺（1d）。C&EN指出，這兩個化合物的質譜和元素分析是完全一樣的，雖然兩個化合物氫譜的芳環信號有所差異，但是如果不將這兩個化合物對比分析很難發現問題。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

第二個例子則是關於誘導腫瘤細胞凋亡的化合物TIC10。這個化合物於1973年和2013年被兩個不同的公司申請了專利。隨後當Scripps研究所人員在研究這個化合物時發現他們製備的化合物居然沒有活性，而從國家癌症研究所（NCI）庫中獲得的TIC10給出了預期的陽性結果。經過仔細分析後發現，被兩個公司先後申請專利的化合物2a沒有活性，有活性的化合物是其異構體2b。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

咱們接下來就按照原文作者的思路學習一下什麼情況下該用什麼NMR實驗鑑定結構。

區域異構（Regioisomerism）

區域異構產物僅通過LC-MS和/或1H-NMR 是很難區分的，而利用HMQC（HSQC）和HMBC可清楚地表徵。在化合物3a中，酯部分位於原子2的間位。在HMBC光譜中，觀察到H2/C1與原子2的具有唯一低場相關性。未觀察到H2/C3交叉峰。這與化合物3a的結構一致。對於化合物3b，酯部分與C2 鄰位，並且在HMBC光譜中觀察到原子2的兩個低場交叉峰（H2/C1和H2/C3）。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

與所有實驗方法一樣，HMBC實驗也有缺點。貫穿鍵的耦合常數會發生很大變化，從而很難區分 3JH,C和 2JH,C。 3JH,C耦合常數除其他因素外，還取決於二面角，並且當二面角接近90°時，顯然不存在交叉峰。因此，在全面分析中必須考慮不存在峰。

另外，作者認為2D-NMR實驗中的ROESY實驗對於闡明結構很有價值，因為它可以提供了分子內空間距離在5埃之內的氫原子信息。區域異構體4a和4b的區別僅在於它們在氮雜苯並咪唑基部分上的連接點。從1H和ROESY NMR數據觀察，一個可以識別的H2/H1和H2/H6相關性，與化合物一致4a。另一個可以識別H4/H1和H4/H6交叉峰，與化合物4b的結構一致。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

幾何異構（Geometric Isomerism）

幾何異構體（E/Z）常見於含雙鍵化合物當中。通過耦合常數即可判別，順式耦合常數通常在3–13Hz和反式在12–20 Hz 。當雙鍵上的氫原子和其他原子存在耦合時會導致出現共振多重峰，這時需要共振去耦，藍色圖譜是選擇性去耦之後的氫譜。對於化合物5a，順式異構體的1 H NMR光譜顯示H2與H1質子和H3耦合而成為多重峰。另一方面，H3被與H5的重疊所遮蓋。由於這一障礙，無法確定3JH3,H2，但是，通過有選擇地將H1解耦（右），質子H2簡化為一個雙峰，從中可以導出與H3的耦合（3JH3,H2 = 9.8 Hz），與順式異構體一致。對於化合物5b，H3與H4偶聯。去耦後，從中可以提取出與H2的大耦合，3JH3,H= 15.2  Hz，與反式異構體一致。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

旋轉異構/阻轉異構（Rotamers/Atropisomers）

旋轉異構是由於化合物受空間因素，電子效應，氫鍵等因素沿單鍵旋轉受限或環翻轉受阻而產生的。如果旋轉/翻轉的障礙大於20 kcal / mol，則會產生手性，從而形成阻轉異構體。小於20 kcal /mol會導致旋轉異構體（共聚體）出現。旋轉異構體無法通過LC方法分離。遇到這種情況，作者提供了常見的解決辦法：變溫（VT）以及ROESY。作者以三級醯胺的NMR變溫實驗和ROESY實驗為例介紹了這種旋轉異構體的NMR信號特點。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

N-烷基化和O-烷基化（N- vs. O-Alkylation）

烷基化反應通常導致不可預測的O-和N- 烷基類似物。採用13 C化學位移可區分由環境性配體形成的N-與O-烷基化產物。如下圖，在N-烷基化類似物中，13 C位移下降至46.8ppm， 而在O-類似物中，信號出現在68.9ppm處 。

立體化學異構體（Stereoisomerism）

確定手性分子的絕對構型最簡便的就是X射線衍射。另一方面，ROESY也是確定手性化合物立體化學的非常實用的方法。對於化合物9觀察到脯氨酸環平面上方的氫原子彼此之間具有強的ROESY峰，而與脯氨酸平面下方的氫原子相比具有較弱的峰。交叉峰2/3的尺寸小於2'/3的尺寸。觀察到了尖峰1/2'和2/4，但沒有觀察到1/2和2'/ 4。5/5'是重疊的，不能用作距離比較，但是2和2'很好地分離了。該數據證實立體化學如圖9 所示。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

文末，作者總結了一個超級實用的表格告訴大家什麼情況應該用哪種NMR技術。

圖片來源：Bioorg. Med. Chem. Lett.

絕對的實用乾貨，適用於大多數有機合成初學者，同學們可以多多轉發，拯救更多被NMR困擾的小夥伴們。我們更歡迎各位整日以鑑定結構為業的植化/天然藥化大牛們也來分享自己的寶貴經驗。

最後，小編給大家推薦兩本書，絕對是學習結構解析的經典教材。一本是藥明翻譯的《有機化合物的波譜解析》，另一本是原著《Spectrometric Identification of Organic Compounds》第八版。英語閱讀無障礙，喜歡原汁原味的同學請看原著；能夠接受翻譯版本的同學就看藥明康德分析部譯的這個中文版吧。

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