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大家都在說 qRT-PCR 實驗原理、引物設計、結果解讀等，而我覺得我應該和大家分享一下 qRT-PCR 的實驗操作事項。雖小，但是關乎結果。
在做 qRT-PCR 之前，我們需要對自己的 RNA 以及操作方法有清楚的了解，畢竟我們的努力是希望得到結果的，而不是簡單的練練手。所以在做 qRT-PCR 之前，我們需要確定以下問題（部分內容僅適用於 SYBR）。
NanoDrop 2000 只能檢測 RNA 的濃度以及純度，而對於 RNA 的完整性是沒法檢測的。
RNA（RNA Intesity Number）值可以反映 RNA 的完整性，通過 Agilent 2100 Bioanalyzer system 來檢測
圖. 不同 RNA 樣本的 RIN 值示意圖（真核生物）
但是實驗室一般不會有 Agilent 2100 Bioanalyzer，在這種情況下，我們可以通過甲醛膠檢測，但是對 RNA 總量的要求高，那麼最快速的方法就是用普通的凝膠電泳。要求在 nuclease-free 的環境下，所以需要將電泳槽、溶膠瓶、凝膠託槽以及梳子用 DEPC 水衝洗乾淨。瓊脂糖也是 nuclease-free（只要是新開封的就行），Loading Buffer 儘可能是新開封的，配置 1.2% 的凝膠。
注意，凝膠一定要保證溶解完全，要不然會導致條帶不均一。電壓太高或者跑太長時間會產熱，導致 RNA 降解，所以要合理控制電壓和時間。此外，跑膠也可以進一步確定樣品中是否有 DNA 的殘留，觀測點膠孔是否有大量滯留的條帶。
圖. 凝膠電泳檢測 RNA
實驗室大師兄的經驗是每次反轉得到的 20 ul 體系的 cDNA 直接稀釋 20X，而博後師姐是按照 10X 稀釋，我一般是看情況而定。因為每個人提的 RNA 質量不同，反轉的水平也分高低，再說反轉的技術也未必穩定。
所以在每次拿到反轉的 cDNA 後，我首先會稀釋 3 倍左右，然後利用管家基因做一次 RT-PCR，循環數一般為 25 cycle，鑑定一下具體濃度，再決定最後的稀釋倍數。
可以通過 qRT-PCR 的溶解曲線，但是呢，這個還是要耗錢的。對於沒有很多錢的實驗室來說，在拿到很多引物的時候，可以通過普通的 RT-PCR 看看是否是單一條帶，鑑定一下引物的特異性。如果實驗室不差錢，則可以通過溶解曲線對所有的引物的特異性做一次鑑定。
如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器，那麼你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因為不兼容的 PCR 板會導致結果偏差。因為我的師姐就真的碰到過這種情況。
SYBR 要避免強光照射，所以在加 SYBR 試劑的時候儘量關掉頭頂的照明燈，只需藉助微光完成就可以。
SYBR 放置 4 ℃ 保存，使用時輕輕上下顛倒混勻即可，避免泡沫產生，切忌用力渦旋。
有些小師妹怕自己加樣搞混，喜歡在 PCR 板上劃出標誌，這樣做是不對的。因為你的標記極有可能影響到螢光信號的採集，所以一般我會建議師妹採用實驗記錄本協助記憶，如下所示。
圖.qRT-PCR 加樣圖
一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情說三遍。
為了減少 SYBR 在光下的曝光，個人喜歡先加入模板， 如下圖。根據經驗，少量模板的加入，容易造成加樣誤差。所以為了儘量減少加入少量模板造成的誤差，我一般會將樣本再稀釋一倍，加樣的時候多加一倍，減少 H2O2 的加入量。
圖.qRT-PCR 加樣示意圖
然後配置 qRT-PCR 體系，如下。
圖.qRT-PCR 體系配製圖
註：配置過程需在冰上完成。
加好樣品後，貼好透明封板膜。儘量不要用手碰透明封板膜的表面，從膜兩邊空餘處操作就行。因為手印也有可能可能影響到螢光信號的採集。然後就是用離心機低速迅速離心 10 S，防止樣本掛壁。
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