多功能酶標儀中螢光檢測技術介紹

　　螢光分析技術是一種強大的分析手段，廣泛地應用在臨床檢驗、生物學研究、農業科學、食品和環境科學中，是多功能酶標儀的重要應用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek(Synergy 4等)，MD(M2、M5)都可以應用於螢光檢測。

　　1.概述

　　室溫下，大多數分子處於基態的最低振動能級，處於基態的分子吸收能量(光能、化學能、電能或熱能)後躍遷至激發態，激發態不穩定，將很快衰變到基態，以光的形式放出能量，這種現象稱為「發光現象」。分子發光包括螢光，磷光，化學發光，生物發光等。受到光照時發光，光照切斷時發光立即消失的叫螢光，光照切斷時，發光逐漸變弱以致消失的叫磷光，吸收化學反應的化學能量而發光叫化學發光，由生物能轉變為光輻射的稱作生物發光。

　　由於發光物質不同螢光有分子螢光和原子螢光之分，分子螢光為帶光譜，原子螢光為線光譜，通常所說的螢光為分子螢光。通過測定所發射螢光的特性和強度，可以對物質進行定性、定量分析。

　　2.螢光檢測技術

　　2.1螢光強度(FI)

　　螢光強度與螢光物質的濃度成正比，這是螢光分析法是量分析的依據。在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量，酶活性分析，螢光免疫分析，細胞學分析(細胞增殖，細胞毒理，細胞吸附等)和分子間相互作用。

　　2.1.1細胞凋亡檢測

　　Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在於胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小 亞基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

　　設計出螢光物質偶聯的短肽Z-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發螢光，短肽被水解後釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射螢光(圖1)。根據釋放的AMC螢光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
                                       Z-DEVD-AMC------AMC 
                                 Nonfluorescent     Fluorescent
                                圖1. Caspase-3水解Z-DEVD- AMC

　　2.1.2細胞毒性的檢測

　　體外細胞毒性研究對於檢測新的生物來源或人工合成的細胞毒素以及例行的臨床相關的檢測都有著重要的意義。細胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細胞膜，螢光密度越高反映出其受損細胞越多。

　　2.1.3鈣流檢測

　　Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+螢光指示劑，可以靈敏地反映細胞內鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時，最大激發波長會發生改變，發射螢光的強度和結合的Ca2+濃度有著定量的關係。

　　2.2螢光偏振(FP)

　　1926年Perrin首先描述了螢光偏振理論，溶液中的螢光分子在受到偏振光照射時，可吸收並釋放出相應的偏振螢光，如果在激發時螢光物質處於靜止狀態，發射光將保持原有激發光的偏振性，如果其處於運動狀態，發射光電偏振偏振平面將不同於原有激發光的偏振特性，這就是螢光偏振現象，螢光分子與其它因子的相互作用，例如相互結合或排斥;其所處環境的性質，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個螢光因子受激發後發出的發射光的發射平面產生影響。因此以螢光偏振為基礎發展的技術可用來研究生命科學中分子之間的相互作用，如受體配體結合分析，DNA-蛋白質結合分析，SNP分析，酶活性分析。

　　螢光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞納摩爾級範圍，重複性好，操作簡便，也更為安全可靠，不會在實驗過程中生成有害的放射性廢物，此外螢光偏振是真正均相的，允許實時檢測(動力學檢測)，對於濃度變化不敏感，是均相檢測形式(中間不含洗滌步驟)的最佳解決方案。

　　目前市場上多款酶標儀都可以用來做螢光偏振檢測，Invitrogene公司專門利用Predictor™ hERG對多款酶標儀進行螢光偏振測試分析(表1)。

　　2.3時間分辨螢光(TRF)

　　在做螢光測定的時候，由於背景螢光信號幹擾，使用傳統的發色團進而進行螢光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景螢光信號是短時存在的，因此使用長衰減壽命的標記物就可以使瞬時螢光幹擾減到最小化。

　　時間分辨螢光是用稀土元素作為標記物，稀土三價離子的電子云的結構會一定程度上限制了電子的遷移，導致這類元素發生的螢光的衰減周期通常是很長的，從而消除背景螢光的幹擾 大大提高檢測的靈敏度(表2)。應用稀土元素作標記物的另一個好處是激發光與發射光峰值Stoke 位移大。這就可消除激發光和散射光的幹擾，同時, 被激發的螢光光帶極窄, 螢光的發射峰非常尖銳, 可使儀器調整在極窄的波長範圍內測定, 極大地降低了來自背景的各種幹擾。

                               螢光團 螢光壽命（ns）
                          非特異螢光背景 1～10
                                 人血清白蛋白 4.1
                                   球蛋白 3.0
                                 細胞色素C 3.5
                        異硫氰酸螢光素(FITC) 4.5
                             丹磺醯氯 14
                        稀土螯合物 103～106
                     表2.常見螢光團隊螢光壽命 

　　時間分辨螢光靈敏度高、特異性強、穩定性好、標記物製備簡便、檢測重複性好、操作流程短，適用於生物學、醫學上的超微量分析，像激素檢測，病毒性肝炎標誌物檢測，靶向細胞的標記檢測以及藥物篩選等方面。

　　2.4螢光共振能量傳遞(FRET)

　　螢光共振能量傳遞現象是Perrin在20世紀初首先發現的，1948年，Foster創立了理論原理，指螢光能量供體與受體間通過偶極-偶極耦合作用轉移能量的過程，這種能量的轉移是非放射性的，產生FRET的條件主要有三個：(1)供體與受體間足夠靠近(1～10 nm);(2)供體的發射光譜與受體的激發光譜有一定的重疊;(3)給體與受體的偶極具一定的空間取向，這是偶極-偶極耦合作用的條件。

　　螢光共振能量傳遞因為要考慮到供體和受體之間的距離，所以經常用來研究分子間的相互作用，像蛋白質的相互作用，抗原抗體結合，受體與配體的結合，另外在膜反應、離子通道等方面的研究也有相應應用。將FRET螢光探針標記的肽鏈，加入到固體表面的雙層膜中，通過螢光漂白恢復(FRAP)成像技術檢測，為研究跨膜螺旋二聚作用提供一個新的方法。用FRET標記細胞質，應用時間分辨技術，檢測其對P2X離子通道的門控作用。

　　利用Eu等長效螢光物質作為供體，來進行螢光共振能量傳遞，在激發光熄滅後受體仍能較長的能量衰減時間，能量傳遞效率更高，可檢測的相互作用距離更長，可達到100-200nm，時間延遲檢測，降低了背景噪音，提高了靈敏度

　　3.總結

　　螢光法靈敏、準確、兼容性強、可以利用螢光分子對目標物質進行特異性標記大大減少雜質的信號幹擾，螢光特性參數多，動態線性範圍寬、可以活細胞活活體檢測，靈敏度比分光光度法高2～4個數量級，對微量和痕量藥物進行靈敏準確的檢測具有較大的優越性。總之螢光法作為一種高靈敏的分析手段，與其它技術相結合，有著更廣闊的發展前景。

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