三種快速支原體檢測試劑盒檢測原理與優缺點比較

2020-09-11 基因獸

在細胞培養，特別是傳代細胞培養中，支原體汙染率達到15-35%。支原體的侵染會引起細胞功能和基因表達的嚴重改變，並造成持續危害。由於支原體汙染會嚴重影響實驗結果的可靠性、重複性和一致性，對支原體的常規檢測非常重要。

傳統的支原體檢測方法很耗費時間，通常需要一天至數周，而且操作比較繁瑣，準確度不高。

中國藥典給定的支原體標準檢測方法有兩種：培養法和DNA染色法。培養法方法簡單，假陽性率低，但樣品需要量高，耗時20天左右，時間漫長。DNA染色法結果直觀，假陽性率低，但需要螢光顯微設備，實驗操作複雜。

能否找到一種省時、省力且準確性高的方法檢測支原體汙染呢？

目前，市場上具有多款支原體快速檢測試劑盒，我們選取了其中3種品牌的快速支原體檢測試劑盒，就其檢測原理與優缺點進行一下比較。


一、美國CLARK Bioscience品牌一步法檢測試劑盒

美國CLARK Bioscience公司研發的一步法支原體檢測試劑盒One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit，利用等溫擴增的方法，可檢測7種常見支原體的基因。

該檢測方法與PCR方法類似，檢測過程中，只需取少量細胞培養上清，及一個能控制溫度的水浴鍋或恆溫金屬浴，其擴增產物的顏色可通過肉眼直接觀察判斷，整個過程需要1小時左右。

該方法對儀器的要求比較低，理論上靈敏度比較高。缺點在於檢測的支原體種類太少，目前已發現的近200種支原體，只能檢測其中的7種，檢測範圍太窄，也不符合國家藥典的規定。而且肉眼觀察結果比較主觀，有可能不同的實驗人員判讀的結果不一致。

二、美國Lonza品牌生物發光法檢測試劑盒

美國Lonza品牌的MycoAlertTM 和升級的MycoAlertTM PLUS支原體檢測試劑盒，採用生物發光的方法，檢測支原體酶活性。其檢測的支原體酶廣泛存在於180多種支原體中，而不存在於真核細胞中。

該方法利用支原體酶的特定活性，進行選擇性的生物化學檢測。當支原體被溶解後，釋放的酶與支原體檢測試劑盒中提供的底物發生催化反應，將ADP轉化成ATP，參與生物發光反應，並可通過分光光度計測定。如果樣品添加底物後讀數上升，表明存在支原體汙染。整個實驗過程需要20分鐘左右。

該方法能夠檢測的支原體種類比較全，檢測結果量化，容易判斷，耗時短。缺點是需要配置發光儀或多功能酶標儀，知名度不如擴增法，靈敏度也可能低於擴增法。

三、蘇州先達基因支原體檢測試劑盒

我國蘇州先達基因（gendx.cn）研發了一種細胞汙染支原體檢測試劑盒，從樣本處理到讀取檢測結果只需30分鐘左右。檢測範圍涵蓋130種支原體。

其原理是基於該公司自主開發的實時螢光恆溫核酸檢測技術（ERA），該技術可以在恆定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內保守性DNA片段進行特異性的擴增，樣本的處理只需吸取200微升的細胞懸95℃水浴2分鐘作為模板，反應體系需置於螢光定量檢測儀中進行，設置溫度為37℃，擴增反應可以在20分鐘內完成，觀察螢光定量檢測儀顯示的擴增曲線判讀檢測結果。

該方法利用了一種恆溫核酸擴增方法，靈敏度比PCR高10-100倍，可以在恆定的低溫條件下進行，而且用時在30分鐘以內，並且檢測範圍涵蓋130種支原體，是一種比較理想的支原體檢測方法。缺點是該試劑盒需要藉助螢光定量檢測儀，儀器往往比較昂貴，不過先達基因推出了專用的螢光定量檢測儀，該方法對溫度控制元件要求不高，所以該儀器相對比較便宜而且小巧。

支原體檢測

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  • 『支原體qPCR檢測』的方法學驗證
    近年來，『支原體qPCR檢測』在工業領域的應用越來越多，但在項目申報前，先需要進行方法學驗證，依據藥典，在檢測限、特異性和耐用性方面達到要求後，才能替代傳統的檢查方法。 就筆者所知，在適合工業的支原體檢測和方法驗證方面，德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司已有很成熟的產品及商業化應用，它不僅提供有符合國際藥典的『支原體qPCR檢測』試劑盒，而且有一系列支原體標準品及輔助產品，用於qPCR方法的全面驗證。這些產品性價比也較高，全球許多客戶都在使用。
  • 「支原體qPCR檢測」的方法學驗證
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  • 知識點：德國MB螢光定量pcr檢測原理
    知識點：德國MB螢光定量pcr檢測原理用途：進口德國Minerva公司的Venor®GeM qEP kit用於定量檢測細胞培養物及其他生物基質中的柔膜體綱微生物，如支原體、無膽甾原體、螺原體。檢測說明：該試劑盒採用螢光定量PCR技術，是已建立的檢測方法，能一次檢測歐洲藥典（EP2.6.7）和日本藥典（JP G3）提到的所有支原體物種，並且能與大多數儀器配合使用。該試劑盒針對支原體基因組中的高度保守區，具有快速、耐用和靈敏的特點。該試劑盒的設計滿足歐洲藥典和日本藥典對於不同類型樣本（如軟骨細胞、血清、細胞培養上清）在DNA抽提後的檢測標準。
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  • 支原體常規PCR方法檢測系列介紹
    小編把MB公司關於支原體檢測和支原體祛除的不同產品，以通覽的形式介紹給大家，希望對中國的生物科研和質檢人員，能有所幫助。支原體常規PCR檢測試劑盒（一步法） 用途說明： 1）適合科研單位檢測，或單位內檢，用PCR法檢測細胞或其他生物基質。 2) 比藥典操作標準合併了一步，（將內控對照試劑預先混合在PCR mix試劑中），操作更簡潔。
  • 鍾南山院士指導研發快速檢測試劑盒,病毒快速檢測技術了解一下
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  • 支原體螢光定量試劑盒（qPCR法）介紹
    螢光定量PCR法（qPCR）：是在常規PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做螢光標記，使PCR擴增後的產物帶有螢光，利用螢光信號的變化和配套軟體，進行DNA擴增反應的實時監測，簡稱qPCR。本文第締一生物為您做支原體螢光定量試劑盒（qPCR法）介紹。
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