以下方案介紹了在下行的轉移緩衝液流的作用下,RNA從瓊脂糖凝膠轉移至膜性支持物的步驟(參見圖6-7)。
1.如方案12步驟1和2所述製備RNA分離凝膠。
2.準備一疊約3cm厚的一次性紙巾。在其頂端放4張濾紙,紙巾和濾紙的長寬均應超過修剪後的凝膠1~ 2cm。
3.用新解剖刀或切紙刀切一片合適的尼龍膜,膜的長、寬均應比膠大約1mm。接觸膜時應戴上手套或用平頭鑷子( 如Mllipore鑷子),因為油膩的手接觸過的尼龍膜不易授溼!
4.將尼龍膜漂浮在去離子水表面直至濾膜從下往上全部溼透,然後將膜浸入轉移緩衝液中至少5min,用乾淨的解剖刀片切去濾膜一角,使其與凝膠的切角相對應。
不同批號的尼龍膜其沒溼速率不同,若膜在水面上漂浮幾分鐘仍未溼透,直接換一張新的膜, 因為未完全浸溼的膜用於RNA轉移是不可靠的。鹼性轉移緩衝適於將RNA轉移至帶正電荷的尼龍膜,而中性緩衝液適於將RNA轉移至不帶電荷的尼龍膜。
5.裁剪4張與膠大小一致的濾紙,用轉移緩衝液徹底浸溼,裁2張大的濾紙用於連接紙巾上層與轉移緩衝液槽(如圖6-7所示)。
轉移系統的安裝和RNA的轉移(參見圖6-7.)
6.迅速將一疊浸溼的濾紙整齊疊放在紙巾,上,然後將尼龍膜準確放於濾紙上,將修正好的瓊脂糖凝膠置於膜上使兩者的切角重疊。在凝膠周圍(不要覆蓋)包裹上塑料膜或者石蠟膜。
▲一旦凝膠置於膜上就不要再移動膠,確保膠和膜之間沒有氣泡。