PBMC可以這樣分離

2021-02-13 科儀嘉欣

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血單個核細胞，顧名思義，其主要細胞類型為血液裡邊具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞（Ｔ＼Ｂ），單核細胞，吞噬細胞，樹突狀細胞和其他少量細胞類型。其中淋巴細胞佔很大一部分。

人外周血單核細胞分離自外周血。在二十一世紀初人類開始的生命方舟計劃中首次提出外周血這一新概念，單核細胞起源於骨髓中的造血幹細胞，並在骨髓中發育。與其他血細胞比較，單核細胞內含有更多的非特異性脂酶，並且具有更強的吞噬作用。固定在組織中的單核細胞稱為組織巨噬細胞，它們經常大量存在於淋巴結、肺泡壁、骨髓、肝和脾等器官。激活了的單核細胞和組織巨噬細胞能生成並釋放多種細胞毒、幹擾素和白細胞介素，參與機體防衛機制。在炎症周圍單核細胞能進行細胞分裂，並包圍異物。

分離PBMC的主要目的是為了將多核細胞和紅細胞去除，從而更方便地對外周血中的單核細胞進行研究。

 

// 分離原理 //

 

分離單核細胞常使用Ficoll作為分離液的主要成分，它是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400000，當密度為1.2g/ml時也未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心後沉於管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小於或等於分離液比重，離心後漂浮於分離液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細胞，就可從外周血中分離到單核細胞，並進行之後的培養與檢測。

 

// 試劑準備 //

 

實驗樣本（全血，未凝結）

滅菌PBS/生理鹽水

人淋巴細胞分離液

 

// 實驗設備 //

 

離心機（需可調製動）

超淨工作檯

移液器

等...

 

// 實驗步驟（含操作要點） //

 

1、取全血，使用等量PBS稀釋。（全血：HBSS=1:1）

2、取離心管，加入與血稀釋液等量的PBS於管底，將血液稀釋液小心加至PBS液面上層。（小心不要使兩種溶液混合，吸頭接近液面，貼壁緩慢加入，尤其是兩種溶液剛接觸到的時候，一定要慢！慢！再慢！）

3、離心：800g，30min，需要將制動降至最低，即離心機自然降速至0，離心完畢將得到如圖所示分層（一定要自然降速，或者只有1-2成的制動）


4、吸取白膜層至新15mL離心管中。（白膜層為如圖所示部位，一定要小心的吸取，不要吸到血漿和下層的分離液也不要將各層溶液攪混，吸取的時候可以先將上層血漿吸掉，這樣更好操作。）



5、白膜層液體加10~15mlPBS離心，300g，10min，棄上清。沉澱再加PBS清洗一次，棄上清。

6、沉澱加入正常培養的完全培養基進行培養，2~3小時，使單核細胞貼壁。

7、鏡下觀察細胞貼壁後，更換培養基，去除未貼壁細胞，保留下來的即為所需的單核細胞。

 

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