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本文轉自：生信菜鳥團
作者：Forest Lee
最近在學實驗，和大家分享下。
先從製備pbmc開始吧。
pbmc 外周血單個核細胞 英文全稱Peripheralblood mononuclear cell，注意這裡並非單指單核細胞
全血由血漿和血細胞組成，我們的目標是拿到pbmc做後續實驗。
我們的原理是利用梯度密度離心法製備。
血漿、pbmc和紅細胞等的密度不同，加上淋巴細胞分離液，離心後全血分層，拿到上清液。
其分離原理是根據血細胞的密度差異（紅細胞和粒細胞密度為1.090 g/mL左右；淋巴細胞和單核細胞密度為1.075~1.090 g/mL；血小板為1.030~1.035 g/mL），通過離心使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將淋巴細胞從人外周血或臍帶血中分離出來。
而我們使用的淋巴細胞分離液是1.077g/mL，介於紅細胞和淋巴細胞之間。
具體步驟如下：以5ml全血為例
取5ml新鮮外周血（EDTA抗凝管）
取兩個離心管，注滿下層（約3-4ml），上層分別加入2.5ml全血
室溫離心 1000g*10min （最佳離心條件需要摸索）
離心後血液分層，從上往下依次是血漿層、淋巴細胞層、淋巴細胞分離液層及紅細胞層，我們要的是淋巴細胞層。
用槍把淋巴細胞層及上層液吸出來，如果有分隔的話，也可以直接倒出來。
離心 500g*4min
棄上清，加入紅細胞裂解液1ml*5min，後加入等量中和液
離心 500g*4min
棄上清，加入細胞凍存液1ml重懸（10%DMSO+90%胎牛血清），後置於凍存管中
各取10ul液體，計數，看細胞活度，一般來講細胞數量能達到106，細胞活度能90%以上
將凍存管置於梯度凍存盒中，放到-80℃冰箱
注意事項：
抽取的外周血，應儘快製備（儘量2h以內），且減少晃動
加入淋巴細胞分離液時，下層應儘量避免氣泡的產生
裂紅時間要足夠；若裂紅離心後下層沉澱仍有紅色，應再次裂紅
提前將梯度凍存盒置於室溫，儘快將凍存管置於-80℃
剛開始做基礎實驗，希望和大家多多交流。
加小編，請備註: 單位+研究方向
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