miRNA 定量方法該選哪種?

最近又遇到的miRNA定量的問題，所以我又把之前的一些內容重新整理了一下，希望能對小夥伴有所幫助。

miRNA的實時定量PCR與普通mRNA的PCR有些不同，這主要是因為 miRNA的自身結構比較特殊。其最大的特點就是長度過於短小，僅僅二十幾個鹼基的核酸片段無法直接應用常規的 PCR 技術擴增。所以，在針對miRNA的PCR技術中，必須要延長待測miRNA 的長度，構建出一個足夠長的PCR模板，才能進一步應用PCR技術 來定量分析。

目前常用的miRNA的定量的方法主要有兩種。

頸環法：

莖環法的原理是，設計一種特殊的莖環結構的反轉錄引物，在反轉錄反應中直接完成模板鏈的延長。

反轉錄引物設計:「莖環」即指反轉錄引物。莖環結構不但能有效地延長miRNA的長度，同時它自身互補的構象可以避免與其他同源基因結合，減少了非特異性擴增的機率。整個引物由2部分組成，一個通用的莖環結構和5～8個與目的miRNA的3'端反向互補的鹼基。

我們拿經典頸環序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介紹。打開DNAstar軟體的PrimerSelect；file打開下拉菜單；打開Enter New Primer…；粘貼頸環序列；點擊OK。

頸環結構已經輸入，下面查看頸環結構會形成的那些髮夾結構。

選擇頸環結構（滑鼠點一下）；點擊Report下拉菜單；選擇Primer Hairpins。

第一個髮夾結構是實驗所需的結構(dG=-20.4kc/m)。

下面結合has-miR-122-5P合成cDNA的具體過程講解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU

將U轉T，方便後面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT

miRNAs的頸環結構引物：是將miRNAs的3』端後6位鹼基反向互補添加到經典頸環結構的3』端形成的結構。(自己根據後面圖片想一下原因，加6個鹼基為經驗所授)

has-miR-122-5P的後6位：GTTTGT

has-miR-122-5P的後6位的反向互補序列：ACAAAC

頸環引物序列：

5』-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3』查看形成的髮夾結構（方法前面有講）

看一下miRNA和頸環引物在一起會是怎麼樣子：

在含反轉錄酶及適當的條件下，miRNA和其頸環引物將會合成cDNA鏈：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA

查看cDNA結構：

我們知道了cDNA的合成過程和序列，同時學習了miRNA的反轉錄過程。

下面進入重頭戲，教大家如何進行miRNA引物設計。

首先如果你的前面實驗是晶片的就在miRbase上再查看核對一遍，如果是測序實驗的需要將miRNA的名字3p或5p及之前的部分複製到miRNA上查找完整序列。將得到的miRNA完整序列複製到一個excel表中，然後使用查找替換將U改為T（一定要記住改換，要不然primer5.0是不認U的）。

為了後面引物設計方便，需要以miRNA序列構建引物，所以需要將miRNA的cDNA的反向互補序列找出。使用primer5.0。

打開File下拉菜單；New；DNASequence。

由於正規設計過程中不會先把cDNA序列找出來，所以直接操作過程為先將miRNA序列（U改T）輸入，再輸入頸環結構序列的反向互補序列。

複製miRNA序列（U改T）；點擊primer5.0序列框，使用組合鍵「Ctrl+V」粘貼序列；選擇正向序列。

複製頸環結構序列；點擊primer5.0序列框，使用組合鍵「Ctrl+V」粘貼序列；選擇反向互補序列輸入Reverse Complemented。

到這一歩cDNA的反向互補序列已經輸入完畢，下一歩是在

primer5.0上進行引物設計。

在序列前面輸入9個N（這個是個人習慣，也有人是6個或以上的A，也有人是不輸入就直接設計引物的），因為miRNA序列太短，很多時候不能設計出符合實驗需要的miRNA，所以在設計正向引物時，一般需要加入3-6個鹼基，最多時加入8個鹼基，以滿足正向引物的設計；

點擊Function框下的Primer，開始設計上下遊引物；

有經典頸環結構自然也就少不了常用的下遊引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同時還可以適當的在頸環序列中前後移動鹼基設計下遊引物；

自動跳出的顯示框中默認選擇的是下遊引物，正好符合先將常用下遊引物輸入的操作。下遊引物相當比較固定，先輸入下遊引物對整個引物設計能夠提高設計效率。

點擊框內的Edit Primers；選擇所有引物序列；使用組合鍵「Ctrl+V」輸入下遊引物，輸入方式為反向輸入Reversed；點擊OK；

點擊Analyze分析引物基本信息；點擊Prime尋找引物在序列裡結合部位；點擊OK確定下遊引物；

點擊上下遊轉換鍵（圖示），開始設計上遊引物；點擊Edit Primers；

去除前面的9個N；點擊Analyze；點擊prime；查看前面不添加序列時的上遊引物狀況如何。

在這裡的主要問題是Tm值太低，第二個問題是長度稍短。

絕大多數情況下在前邊添加的序列以GC為主，且在加GC序列時如果序列中間不以AT隔開則TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出現GCGC、ATAT、GCCG、或連續4個不同的核苷酸，這些失誤會造成引物評分的降低。個人喜歡加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。

例如加入ACGGGC（5』端加入，別在3』端）；點擊Analyze；點擊primer；查看引物的長度和TM值差不多了就行。當然不是全行了，還要查看引物的自身頸環結構，自身引物配對，重要指標為dG。下遊引物不用看了，因為是經典嘛。點擊OK。

再查看一下引物對之間的匹對情況，加以對上遊引物的修改，或者更換下遊引物。有必要點擊比對框下的All查看匹對情況。

加 PolyA 尾法

加尾法的原理則是先對miRNA進行加PolyA尾處理，改造成mRNA的結構，再採用mRNA常用的oligo(dT)反轉錄引物進行反轉錄，從而得到較長的模板鏈。

反轉錄引物:加尾法的反轉錄引物實際上就是處理mRNA所用的通用oligo(dT)引物在反轉錄前有一個步驟是為RNA樣品加PolyA尾，然後反轉錄。所以它的反轉錄引物中包括:一段通用序列、一段多聚T和一個單鹼基錨定。單鹼基錨定的概念源於mRNA分析技術中的差異顯示(Differential display)技術。其原理是藉助mRNA的PolyA尾，對大量的mRNA進行分類。這種在多聚T後加上一個A或C或G的簡併反轉錄引物，能將所有mRNA分類為3種，這就是單鹼基錨定。給miRNA加上了PolyA尾後也可以用這種方法，設 計簡併反轉錄引物。例如，5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG( T)24 V(A\G\C)-3' 5'-GCTGTCAACGATACGCTACG-3'-對應的通用PCR下遊引物或5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)12 V(A\G\C)N-3' 5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'對應的通用PCR下遊引物，V為錨定鹼基。也就是說，研究者只需合成這3種反轉錄引物就足夠了。在反轉錄時，將3種引物一同加入反應體系中，將所有序列反轉錄。

PCR擴增引物:加尾法的上遊引物的設計相對簡單，大多數只需直接將目的 miRNA的成熟序列中的U改為T。這時將模板序列上下遊引物放到BeaconDesigner7中檢驗，在上遊引物的兩端適當地刪減幾個鹼基，調整引物的GC比和Tm值，儘量保證不出現自身二聚體即可。加尾法不用考慮反轉錄引物與上遊引物形成二聚體的問題。以hsa-mir-26a為例，可見上遊引物設計只是將所有的U改為T而已，上遊引物:5'-TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT-3'，成熟序列:5'-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3'。再以hsa-mir-21為例，不僅改變T外，還在3'端刪去了一個A，上遊引物:5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTG-3'，成熟序列:5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。

兩種方法的比較

無論是莖環法還是加尾法，其引物的設計最終要得到「一對半」，「一對」是指PCR擴增的上下遊引物，「半」是反轉錄引物。這3個引物是完成整個實時定量實驗所必須的。比較一下2種方法所設計出的引物，不難發現，加尾法的引物設計起來更加容易，當要測定的miRNA種類很多時，加尾 法的優勢就更加明顯了。在反轉錄引物上，加尾法應用的差異顯示原理簡併了3種引物，而莖環法則需要逐一設計相應的反轉錄引物，隨著數量的增加，成本也會拉開差距。在PCR的擴增階段，雖然兩者都有通用的下遊引物，但是，由於莖環法特殊的原理，設計上遊引物時會比較麻煩，並且在真正的操作中難度還要大，因為目前的軟體還不能自動設計超出模板鏈的引物，需要設計者將模板鏈與引物序列一同修改，操作繁瑣。這一問題的出現，歸根結底還是因為miRNA的長度過短所致。miRNA的序列和引物的序列都很短，幾個鹼基的變化就可能導致整個miRNA或引物的特性的改變，多數miRNA對2種方法都適用，但也有特殊情況。所以在大量檢測miRNA時，加 尾法應是首選。另外，由於加尾法的特異性不如莖環法，故莖環法可作加尾法的候補方法，檢測那些加尾法效果不理想的miRNA。

內參

除「一對半」的引物之外，實時定量還要設置內參。目前比較常用的是U6。U6是核小RNA，其序列較長，可直接進行擴增，反轉錄引物就是擴增的下遊引物。如:
上遊引物 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'
下遊引物 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'或者
上遊引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'
下遊引物 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

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