數字PCR是近年來迅速發展起來的一種定量分析技術。該技術結果判定不依賴於擴增曲線的循環閾值（Ct），不受擴增效率的影響，具有很好的準確度和重現性，並且可以實現絕對定量分析。數字PCR已經在核酸檢測、鑑定等研究領域顯示出巨大的技術優勢和應用前景。本推送主要介紹dPCR的歷史和發展、dPCR的基本原理和商業化dPCR平臺及其特點。
dPCR的歷史和發展
數字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一種核酸分子絕對定量技術。相較於qPCR，數字PCR能夠直接讀出DNA分子的個數，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。dPCR起源於Cetus Corporation於1988年首次發表的方法，當時研究人員證明可以通過PCR檢測和擴增單個β-珠蛋白分子。這是通過將樣品分開來完成的，因此某些反應包含該分子，而另一些則不包含。1990年，Peter Simmonds和AJ Brown首次使用此概念對分子進行量化。Alex Morley和Pamela Sykes於1992年正式建立了該方法作為核酸的定量技術。
1999年，Bert Vogelstein創造了「數字PCR」一詞，文章正式報導於美國科學院院刊PNAS，並表明該技術可用於發現罕見的癌症突變。作者是美國癌症研究者、霍華德·休斯醫學研究所研究員貝爾特·福格爾斯泰因（Bert Vogelstein）。
文章通過在結腸癌患者糞便中檢測KRAS基因突變，並重點突出了dPCR定量檢測的能力和潛力（由於PCR是一個指數過程，因此qPCR只能觀察到兩倍的擴增差異，文章卻重點突出了dPCR區別這種微小差異的能力）。但文章僅僅把樣本分配到384孔板中，分別用不同螢光檢測突變基因和正常基因，通過計算突變基因和正常基因的比例來得出突變率。儘管為了能夠提高檢測性能需要將樣本分配到更多的微孔或液滴中，但基本的思想都離不開Bert Vogelstein所建立的dPCR理念。
2003年，Kinzler和Vogelstein繼續完善dPCR，並創建了一種改進的方法，他們將其稱為BEAMing技術，即「珠子，乳狀液，擴增和磁性」的首字母縮寫。BEAMing技術使用乳狀液在單個試管中分隔擴增反應。這一變化能在一次運行中將該PCR擴展到成千上萬的反應。
自此，關於dPCR兩種形式（晶片式和液滴式）的基本方法都已經建立，企業界的大佬也正式開啟了dPCR的商業化進程。
dPCR的基本原理
目前dPCR主要有兩種形式，晶片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋後的核酸溶液分散至晶片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少於或者等於1個。這樣經過PCR循環之後，有一個核酸分子模板的反應器就會給出螢光信號，沒有模板的反應器就沒有螢光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
可以使用幾種不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數量，根據泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標分子存在於單個液滴中的可能性。
同時，從公式也可以看出，隨著反應陽性體系數（X）的增加，體系中目標分子的拷貝數相對於X會有較大的差距，隨著X的持續增加，數字PCR結果的不確定度也隨著提高，總體來說，數字PCR陽性體系的數量不得超過總體系數量的80%。另一個方面，N的增加會使整個數字PCR體系具有較大的線性範圍，並可以提高反應的靈敏度、穩定性以及可重複性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情況下，增加分配的腔室數和液滴數。
商業化dPCR平臺及其特點
發展到現在，市面上常見的dPCR主要有兩種：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和晶片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技術。由於晶片式dPCR製造晶片的成本較高，目前微滴式dPCR正越來越受到企業的認可。
cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系統以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系統為代表。Bio Mark系統採用微泵閥式晶片，以聚二甲基矽氧烷為晶片材料，主要依靠微流控通道與閥門的開閉進行原始體系分割，在晶片的反應倉進行PCR反應，然後通過類似於基因晶片的方法掃描每個通孔的螢光信號，進行目的序列含量的計算。QuantStudio 3D系統採用陣列微池式晶片，反應液由進樣孔直接進入各微反應池。晶片式dPCR生成微滴體積均一，具有較高的穩定性，體系之間影響較小，但技術操作複雜，通量有限且實驗成本較高。
ddPCR主要有Bio-rad公司開發的QX200系統和Rain Drop系統，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應體系進行微滴化處理，利用微滴發生器製成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量獨立的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應以後，分析每個微滴的螢光信號，進行有或無的判斷，將判斷結果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內參核酸的陽性微滴個數以及比例從而得到靶分子的拷貝數及濃度。與晶片式dPCR相比，操作簡單，可以實現高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩定性。
與常規的PCR的方法相比，dPCR有很好的優勢。
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絕對定量
常規PCR和實時螢光PCR定量檢測都需要已知拷貝數的標準DNA制定標準曲線，由於樣品測定在各種條件上不會完全一致，會造成PCR擴增效率的差異，從而影響定量結果的準確性。而ddPCR不受標準曲線和擴增動力學影響，可以進行絕對定量。
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樣品需求量低
在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯的優勢。
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高靈敏度
ddPCR本質上是將一個傳統的PCR反應分成了數萬個獨立的PCR反應，在這些反應中可以精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，且能避免非同源異質雙鏈的形成。
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高耐受性
由於目的序列被分配到多個微滴中，顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對反應的幹擾，擴增基質效應大大減小。
具體每種PCR的對比如下表所示：
於此同時，dPCR也有一些缺點，數字PCR系統成本高，通量有限、操作繁瑣等不足。晶片式dPCR由於晶片加工成本高，系統複雜度高，使得商業化優勢不是特別明顯，特別是目前大多數分子診斷qPCR也能夠很好的滿足需求，dPCR增加的收益成本比並不算高。液滴式相對晶片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR擴增和檢測都分別在不同儀器中完成，增加了很多操作，也增加了系統的複雜性，從這點上看全自動螢光定量PCR做的更好。
個人總結
儘管dPCR被稱作第三代PCR技術，但dPCR技術的廣泛應用逐漸顯現出一些不足之處。通量不高、操作複雜，同時成本大大增加，dPCR似乎還沒有找到相對qPCR足夠的不可取代性優勢。另一方面，dPCR增加了很多技術難點，如何製作成本低廉的晶片，如何集成液滴生成和PCR擴增，如何進行靈敏的信號檢測和分析，如何提高自動化程度，實現Sample-In Result-Out。相較於Digital ELISA能夠提高免疫檢測的靈敏度到fg/mL級別，實現了高敏蛋白的檢測，dPCR儘管發展更早，卻難以取得Killer Application，或許這也導致了所謂的第三代PCR在很多人看來卻沒那麼「下一代」。