用RT-PCR檢測單純皰疹病毒
RNA的聚合酶鏈反應(RNA-PCR),可能通過檢測HSV不同期的RNA,這不僅可診斷HSV感染,而且有利於HSV的潛伏期感染機制的深入研究。
RT-PCR是以RNA為模板經逆轉錄反應(RT)產生cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增以達到檢測目的。因此,RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
1、標本處理:
組織塊細胞總RNA提取,取100mg組織標本,加1ml硫氰酸胍變性液,於勻漿器中,室溫研磨均勻後,移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻,用力振搖10s, 置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質)加入等體積異丙醇置-20℃1h,沉澱RNA。離心 15000r/min×10min,棄上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解,再加0.3ml異丙醇沉澱,-20℃1h, 沉澱RNA. 離心15000r/min×10min,去上清, 沉澱RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空乾燥。.加10μl TE緩衝液(pH7.4)溶解,低溫保存備用.臨用前冰浴溶解。
2、PCR擴增:
(1) 引物設計: 選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因.設計2個引物,
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴增ICPO 中266bp序列。
1個探針:5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
(2)PCR實驗體系:總反應體積為50μl,模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L);4×dNTP 4μl(200μmol/L); 10×緩衝液5μl; AMV(逆轉錄酶)2μl(50U); DW 26μl; 循環參數, 94℃變性2min後 94℃50s,60℃60,72℃60s,循環40次後72℃延伸5min。
3、擴增產物的鑑定:
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法:取10μl PCR擴增產物加4μl 樣品緩衝液,混勻後加樣2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳15-20min,EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。
(2)Southern印跡雜交法:用32P標記的特異性探針檢測PCR產物,方法同上。
總之,在HSV感染性疾病的臨床診斷中,PCR能對前病毒或潛伏期低複製的HSV特異性靶DNA片段進行擴增檢測,遠較DNA探針敏感,並能在血清中抗體出現前就可以檢出。因此,PCR無論是作為基礎研究手段,還是作為臨床檢驗診斷方法,均具有廣闊的前景。
五、病理組織學診斷
細胞內水腫,基底層形成大水皰,病灶周圍有多核巨細胞浸潤,特別是多核白細胞與淋巴細胞充斥於病灶中間。