自我國新冠肺炎疫情爆發以來，已有將近8萬人被確診，迄今尚未找到有效的治療手段。而拿到有活性的病毒對於疾病診斷、動物模型建立、中間宿主確認、疫苗藥物等的研發都至關重要。所以在2020年1月7日晚，中國疾控中心從臨床樣本中成功分離到病毒並於1月24日發布了相應毒種信息及其電鏡照片。1月28日，李蘭娟院士也表示其實驗室已經分離到三株新型冠狀病毒；上海也於2月7日成功分離並鑑定出新型冠狀病毒毒株……
但是國外的相關科研機構並不能便利地獲取這些毒株，於是瑞士的科學家利用反向遺傳學的方法， 人工合成了有活性的新冠病毒 。相關結果已經發表在預印本網站上 bioRvix ，題目為「Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform」。
反向遺傳學是相對於經典遺傳學而言的。經典遺傳學是從生物的性狀、表型到遺傳物質來研究生命的發生與發展規律。反向遺傳學則是在獲得生物體基因組全部序列的基礎上，通過對靶基因進行必要的加工和修飾，如定點突變、基因插入\缺失、基因置換等,再按組成順序構建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個體，研究生物體基因組的結構與功能，以及這些修飾可能對生物體的表型、性狀有何種影響等方面的內容。與之相關的研究技術稱為反向遺傳學技術。
RNA病毒的反向遺傳學，是採用病毒的遺傳材料，在培養細胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質。能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆，一般是在細菌質粒中含有整個病毒基因組的cDNA拷貝，使得cDNA本身或從cDNA體外轉錄所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遺傳系統通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測被拯救的人工改造病毒的表型，可以在體內(invivo)有效地研究病毒基因結構、功能和病毒-宿主相互作用。自1978年第一例RNA病毒Qβ噬菌體的成功拯救以來，各類RNA病毒的分子生物學研究取得了長足的進展，這主要歸功於各種RNA病毒反向遺傳系統的建立和發展。該技術的核心是首先構建RNA病毒的全長cDNA分子，並使之受控於RNA聚合酶啟動子，通過體外轉錄過程再次得到病毒RNA，然後將該轉錄物RNA轉染哺乳動物細胞可拯救到活病毒，由於這種拯救病毒是來自全長cDNA分子，因此可以在DNA水平上對病毒基因組進行各種修飾或改造，然後通過拯救病毒的表性變化來判斷這些基因操作的效果，從而達到對病毒基因組表達調控機制，病毒致病的分子機理等進行研究的目的，甚至還可以得到減毒毒株，開發新型的疫苗。目前已有許多RNA病毒的全長感染性cDNA克隆構建成功。
新冠病毒（SARS-CoV-2）也是一種RNA病毒，作者首先根據病毒的RNA序列拿到了相應的DNA模板。由於整個序列長度太大，無法穩定地在工具菌當中穩定複製，因此，作者利用酵母採取了一種成熟而巧妙的辦法： 轉化偶聯重組技術（transformation-associated recombination, TAR) 。
TAR克隆技術能夠快速、準確地從基因組中分離得到所需要的基因或染色體目的片段。 傳統的獲得目的片段的方法是首先建立基因組文庫，在經過篩庫、酶切、連接等複雜的步驟來獲得篩庫的方法費時、費力，在建庫過程中一些不可避免的認為操作可能使DNA產生斷裂、缺口或不同染色體連接起來產生YAC嵌合體，這樣經過篩庫得到的目的片段往往不全或有缺失，有時目的片段不在一個YAC克隆中，需要對篩選的片段進行連接。 TAR克隆技術直接從基因組中分離目的序列，不需要提前建立基因組文庫，只需將基因組DNA和線性化的TAR載體共同轉染到酵母中，利用酵母細胞中高效的重組體系，是載體與基因組的同源序列進行重組，將目的片段重組到TAR載體中，即可產生帶有目的片段的YACs克隆。
具體流程
作者首先利用其實驗室已有的帶有GFP的肝炎病毒株（MHV-GFP）評估了一下該體系的可行性。從MHV-GFP中擴增得到了7個帶有重疊序列的DNA片段，然後與相應的TAR載體（pVC604）共同轉染進入酵母 (strain VL6-48N)，經過檢測90%的克隆株呈現陽性結果，作者又隨機選取了兩株進行了純化，最終通過T7 RNA聚合酶得到了相應基因組RNA。並且後續驗證得到了有活性的病毒株，證明了該體系的可行性。
後續作者又拿MERS-CoV進一步驗證了該體系同樣適用於冠狀病毒，並且可以方便的進行點突變。
最後才將該體系應用於SARS-CoV-2病毒。作者先將得到的DNA分成了12個長0.5-3.4 kbp具有重疊末端序列的DNA片段，並且為了方便後續觀察，引入了GFP（綠色螢光蛋白）序列，通過酵母中同源重組系統，使得反義DNA在酵母中重組成完整的基因序列。之後，在體外，用T7 RNA聚合酶將反義DNA轉錄成為有感染性的病毒RNA。通過電穿孔將RNA導入後，發現正常的VeroE6細胞能夠被感染並發出螢光。
另外，在文中，作者也表示該體系也適用於快速重建多種具有活性的RNA病毒，包括冠狀病毒科、黃病毒科（寨卡病毒）和副粘病毒科（呼吸道合胞病毒B型，RSV-B）。
研究的意義
該研究開發了一種基於合成基因組學的重建大型RNA病毒的系統，能夠快速合成大量有活性的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），以及其他RNA病毒，該系統無需臨床樣本，即可向衛生當局和實驗室提供有活性的病毒樣本，突破了病毒來源的限制。
另外，隨著疫情的進展，病毒可能會出現基因序列變異和表型變化，利用這一系統，能夠快速將這些變異引入，並實時表徵新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的功能，便於及時應對。
總的來說，這項研究開發的新系統，突破了病毒來源的限制，能夠在短時間內（一周）大量生產或改造活性病毒，以用於疾病診斷、動物模型建立、中間宿主確認、疫苗研發等研究。更重要的是，RNA病毒的變異能力較強，新冠病毒作為一種大型RNA病毒，也存在變異風險，這項新技術能夠快速合成構建變異病毒，並進行實時表徵，對實時變化的疫情做出更快速的反應。
參考資料：
https://doi.org/10.1101/2020.02.21.959817
部分內容參考自百度百科，BioWorld公眾號等
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