牛布病(Brucellosis)酶聯免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用於檢測牛血清，血漿及相關液體樣本中布病(Brucellosis)水平，感染人的血液學診斷。
實驗原理：
本試劑盒採用雙抗體夾心酶聯免疫法（ELISA）測定標本中牛布病(Brucellosis)。用純化的牛布病(Brucellosis)抗體包被微孔板，製成固相抗體，可與樣品中布病(Brucellosis)相結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分後再與HRP標記的布病(Brucellosis)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體複合物，經過徹底洗滌後加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中牛布病(Brucellosis)的存在與否。
試劑盒組成：
| 試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
| 說明書 | 1份 | 1份 |
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| 封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
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| 密封袋 | 1個 | 1個 |
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| 酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
| 陰性對照 | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 陽性對照 | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 酶標試劑 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘後，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反覆凍融，以使細胞破壞並放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本後，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化後仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝後一份待檢測，其餘冷凍備用。
6. 標本採集後儘早進行提取，提取按相關文獻進行，提取後應儘快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於-20℃保存，但應避免反覆凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1. 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然後在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl。加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml後備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鐘以內進行。
結果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10
臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為布病(Brucellosis)陰性
陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為布病(Brucellosis)陽性
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉汙染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月