酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定傷寒桿菌「O」抗體

酶聯免疫吸附試驗是用酶標記的抗體（或SPA）檢測未知抗原或抗體的方法。此法敏感性高，特異性強。常用的是ELISA方法，間接法，雙抗體法和抗原法。本次試驗介紹，酶聯葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，見圖9

1.加抗原使之吸附於固相載體（如塑料反應板）
2.洗滌加待測血清
3.洗滌加酶標記SpA
4.洗滌加酶的底物。經酶的催化產生有色產物。

材料：
1.聚乙烯塑料反應板（PH9.6時可吸附蛋白Ag）
2.抗原：傷寒桿菌O901煮沸或超聲波粉碎抗原
3.待測血清
4.凍幹酶聯葡萄球菌A蛋白（HRD—proteinA）純品
5.鄰苯二胺（OPD）
6.包被液：0.05M碳酸鈉—碳酸氫鈉溶液PH9.6
7.稀釋液：10%免疫血清PBS—吐溫20，防止非特異性吸附
8.洗滌液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特異性吸附
9.底物溶液：0.02M磷酸氫二鈉25.7毫升
0.1M檸檬酸24.3毫升
蒸餾水50毫升
臨用前新鮮配製，在上述緩衝液中溶解40毫克鄰苯二胺，然後加入30%雙氧水0.15毫升，底物對光敏感，需要避光並立即使用。
10.終止液；2M硫酸
方法：
1．抗原包被
取潔淨的聚苯乙烯微量反應板，於每孔內加傷寒抗原0.1毫升（用包被緩衝液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小時，棄抗原液，用洗滌液3次每次3分鐘。
2．加待測血清
於每孔內分別加不同稀釋度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待測血清，PBS空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各0.1毫升。置37℃30分鐘，洗滌3次。
3．加酶聯A蛋白
於每孔加酶聯A蛋白各0.1毫升，置37℃20分鐘，洗滌3次。
4．加臨時配製的底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2M碳酸1滴終止反應。
5.結果判斷：（肉眼判斷）
若顏色於陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據顏色深淺以（ ）表示。