LncRNA相關研究這麼多,這些策略你知道嗎?

　　解螺旋公眾號·陪伴你科研的第1777天

　　對於乳腺癌來說，MALAT1到底是抑制了轉移還是促進了轉移呢？

　　今天就以發表在Nature Genetics這篇「Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis」文章為切入點，說的是lncRNA MALAT1抑制乳腺癌的轉移，問題是大部分文章是說MALAT1促進乳腺癌等腫瘤的轉移。

　　到底哪裡出問題了呢? 之所以會出現促進轉移的表型，是因為MALAT1這個基因的位置位於臨近基因（NEAT1，FRMD8）的轉錄調控區，當我們通過基因敲除的方法把這段MALAT1基因的序列敲掉後，不僅會敲除 MALAT1基因，其臨近基因的表達也會受到影響。

　　目前大多數的功能性研究都集中在使用siRNAs、shRNAs或者ASOs，這些RNAs只能干擾已經生成的RNA轉錄本，不能有效的消耗lncRNA的靶標，並且可能產生一些意想不到的後果。siRNAs/shRNAs主要在細胞質中活化來介導RNAi，而lncRNA的靶標通常在核裡。

　　此外，越來越多的證據表明siRNAs/shRNAs可通過轉錄基因沉默改變細胞核中的轉錄。因此，使用siRNAs/shRNAs產生的功能性結果可以通過染色質的表觀遺傳沉默和/或RNA聚合酶II活性的降低來間接介導，這種作用效果的不確定性增加了研究者對ASO介導方法的偏好。

　　現有研究表明，ASO是通過RNaseH依賴性機制引發細胞核中RNA的降解（如下圖所示），並且尚未有報導指出這種機制可以改變染色質的結構。因此，當前實驗方法的局限性阻礙了lncRNA轉錄過程中的作用與lncRNA本身分子作用的全面分離。

　　為了阻斷轉錄，許多研究採用了RNA聚合酶II起始或延伸的抑制劑，但這些抑制劑往往也會抑制靶基因的轉錄，因此它們在功能研究中的用途就受到了限制。

　　目前，基於啟動子缺失和插入轉錄終止位點的基因編輯技術，使用序列特異性核酸酶，如鋅指酶、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）或CRISPR/Cas9是非常有前景的研究lncRNA功能的方法。

　　前面提到的「Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis」中作者採用CRISPR方法在基因組上引入終止子（如下圖所示），從而可以更真實的反應MALAT1本身的生物學功能。

　　而調節位點的deletion是不能夠區分是DNA序列的作用還是由該區域產生的lncRNA的作用。因此，在基因組上引入終止位點可能是研究lncRNA比較有前景的方法，而對於eRNA (Enhancer RNA)，其合成往往是在轉錄起始位點的下遊終止，所以這種方法也不會改變大多數eRNA的產生。

　　近年來，CRISPR interference (CRISPRi) 和CRISPR activation (CRISPRa)基於核酸酶活性失活的Cas9 (dCas9)與效應結構域 (幹擾或激活)融合，這項技術將為研究ncRNA提供更好的手段。此外，通過對RNA聚合酶II形成空間位阻，單獨使用dCas9而不與效應結構域融合來實現的CRISPRi可以在不改變局部染色質結構的基礎上來研究ncRNA轉錄的作用。

　　然而，儘管有很多工具可用，但是迄今為止尚未開發出用於阻止特定位點的轉錄而不影響該區域的其他特徵的好方法。總之，為了得到可靠的實驗結果，我們應該使用多種不同的方法來進行功能缺失實驗，做下遊靶基因或者臨近基因的改變的話，需要通過Rescue實驗進一步驗證，以確保得到科學的結論。

　　下圖是對研究lncRNA所使用的策略總結，還有每種策略的局限性：

　　技術推動科學的發展，在科學研究的道路上還需要我們不斷創新開發更好的工具來探索生命科學的奧秘，大家努力加油吧！

　　附：關於lncRNA敲減策略選擇

　　關於lncRNA幹擾策略問題，雖然siRNAs/shRNAs/ASO已經成功地用於幹擾特定的lncRNA，但每種方法對於不同的lncRNA起到的幹擾效果可能會有所不同。首先要考慮的就是lncRNA的亞細胞定位。

　　如下Fig.1所示，針對於細胞核定位的兩種lncRNA (MALAT1和NEAT1)，使用ASO明顯比siRNA起到更好的抑制效果；針對於細胞質定位的lncRNA (DANCR和OIP5-AS1)，如Fig.2所示，siRNA發揮出了明顯的優勢；而對於細胞核和細胞質都有定位的lncRNA (YUG1、CasC7、HOTAIR)，單獨使用siRNA或ASO都沒有前面兩種效果好(Fig.3)。

　　Fig.1

　　Fig.2

　　Fig.3

　　但是，聯合使用siRNA和ASO卻能達到很好的敲低效果，並且針對於單純細胞核定位或是細胞質定位的lncRNA而言，ASO和siRNA一起使用都比單獨使用有更好的幹擾效果（圖4）。有趣的是，對細胞質定位的lncRNA採用ASO敲低可能比siRNA作用於細胞核定位的lncRNA更為有效(如圖5)提示我們細胞質中RNaseH1的活性水平可能高於我們先前了解的水平。最近研究表明轉染ASO後，mRNA降解的限速步驟與RNaseH1的數量有關，進一步表明了在細胞核和細胞質中都有RNaseH1活性。

　　Fig.4

　　Fig.5

　　總之，當我們要幹擾lncRNA時，首先考慮其定位，反義寡核苷酸ASO用於細胞核定位lncRNA，RNAi用於細胞質定位lncRNA，當lncRNA定位未知時，如果只用一種方法的話，優先選用ASO敲低可能會更好，聯合使用ASO和RNAi往往會達到比單一方法更有效的敲低效果，這種聯合方法又特別適用用核質雙定位的lncRNA。

　　第二屆「翡翠擂臺」已經開始