背景
免疫療法已被廣泛用於癌症的治療。癌症免疫療法旨在激發自身免疫系統來對抗腫瘤，是癌症療法中發展最快的領域之一。其中，程序性細胞死亡-1/程序性細胞死亡-配體1（PD-1 / PD-L1）是免疫腫瘤學領域最有前景的靶標之一。
PD-1與B7家族的兩個配體PDL1和PD-L2結合。研究表明，腫瘤微環境可以誘導浸潤的T細胞過表達PD-1蛋白，而PD-L1（PD-1的配體）在腫瘤細胞中過表達。PD-1與其配體PD-L1的結合導致癌症患者T細胞功能的下調，從而抑制了抗腫瘤免疫能力並導致T細胞衰竭。PD-1/PD-L1抑制劑可阻斷PD-1與PD-L1的結合，幹擾負調控機制，並增強T細胞的活性，從而增強免疫反應。
PD-1/PD-L1抑制劑，也稱為免疫檢查點抑制劑，在各種類型的癌症中均有效。到目前為止，美國FDA已批准了六種用於癌症治療的免疫檢查點抑制劑，均為單克隆抗體，包括Ipilimumab（抗CTLA-4，百時美施貴寶），Pembrolizumab（抗PD-1，默克），Pembrolizumab（抗PD-1，百時美施貴寶），Duvalumab（抗PD-L1，阿斯利康），Atezolizumab（抗PD-L1，羅氏）和Avelumab（抗PD-L1，輝瑞和默克）。抗體介導的免疫檢查點阻滯已在不同類型的腫瘤（例如惡性黑色素瘤，頭頸部鱗狀細胞癌和轉移性非小細胞肺癌）中顯示出臨床效力。然而，治療性抗體具有若干缺點，例如免疫原性，循環半衰期長，組織和腫瘤滲透性差，口服生物利用度低以及生產成本高。此外，當前可用的抗腫瘤單克隆抗體僅靶向細胞外受體/蛋白質（僅佔癌症生物標誌物的一小部分）。
與單克隆抗體相比，用於癌症免疫治療的小分子PD-1 / PD-L1調節劑通常具有合理的藥代動力學特性，包括更好的組織和腫瘤滲透性，更高的口服生物利用度，可接受的半衰期等。此外，可以口服給藥提供了在治療過程中改進臨床劑量的可能性。因此，小分子的PD-1 / PD-L1調節劑有可能克服治療性抗體的現有缺陷，並且還可以與抗體聯合使用，發揮協同的抗癌作用。
三年來，已經發現了數十種小分子PD-1 / PD-L1抑制劑，其中大多數仍處於臨床前研究階段。迄今為止，已報告了三類非mAb小分子：（1）作為直接競爭性PD-1 / PD-L1調節劑的肽（例如，Peptide-1）；（2）破壞PD-1 / PD-L1相互作用並誘導PD-L1二聚化的小分子（例如BMS-8，BMS-202，間苯二酚衍生物）；（3）作用方式未知的小分子（例如SA-49）。CA-170是第一個類藥性PD-L1小分子抑制劑，目前正處於I期臨床試驗（NCT02812875，治療晚期實體瘤和淋巴瘤）。最新的研究表明，CA-170和PD-L1之間沒有直接結合。需要進一步研究CA-170的作用機理。
儘管用於癌症免疫療法的小分子PD-1/PD-L1抑制劑前景廣闊，但設計小分子抑制劑仍然具有挑戰性，因為PD-L1中的結合口袋是疏水的，平坦的，空間較大且沒有深的結合口袋。
基於對接的虛擬篩選和藥物設計，南方醫科大學和廣州中醫藥大學合作設計，合成並評估了多種新型骨架（包括查爾酮，類黃酮和間苯二酚二苄基醚）的PD-1 / PD-L1的小分子抑制劑。其中，NP19表現出了傑出的體外活性（IC50 = 12.5 nM）和優良的體內抗腫瘤效力。
基於對接的虛擬篩選和藥物設計
研究人員通過基於虛擬篩選的藥物設計發現了幾種靶向人PD-1 / PD-L1相互作用的苗頭化合物（化合物庫：Targetmol；軟體：Schrodinger Suite）。其中，排名第一的化合物Bavachinin為黃酮類支架。
對接顯示，Bavachinin相對較好地嵌入了由二聚體PDL1形成的疏水腔體——黃酮骨架與ALA121和TYR56具有疏水相互作用。但Bavachinin缺乏與PD-L1的一些關鍵相互作用，如BMS-202與TYR56的π-π相互作用。
根據對接結果，研究者保留了Bavachinin的黃酮骨架，並在黃酮骨架中引入2-甲基聯苯以模擬BMS-202與TYR56殘基形成的π-π相互作用。基於此，研究者將2-甲基聯苯引入類黃酮主鏈並變化其他位置的取代基，設計製備了一系列新穎的黃酮和查耳酮衍生物。
查爾酮衍生物CET1-13的生化評價.
查爾酮化合物CET1-13使用HTRF分析法進行評估。其中CET3活性最佳。
CET3及BMS-202的分子對接結果顯示，查耳酮骨架很好地嵌入結合口袋，且聯苯部分與TYR56呈現π-π相互作用。然而，與BMS-202相比，尾部基團與周圍胺基酸的結合模式呈現顯著差異（以紅色圓圈突出顯示）。
黃酮衍生物HT1-13的生化評價.
系列化合物中，HT11體外活性最佳。
HT11的分子對接結果顯示。其很好地嵌入了由二聚體PD-L1形成的疏水腔，並且保留了與TYR56的關鍵相互作用。此外，黃酮骨架的吡喃酮部分與TYR56（來自PD-L1二聚體的另一條鏈）形成新的π-π相互作用。然而，黃酮骨架的羰基通過迫使周圍的胺基酸殘基翻轉從而致使疏水口袋變大（C中用紅色圓圈突出顯示）。因此，在該區域中取代小環（例如5元環和4元環）可能將增加其活性。
研究人員進一步分析BMS-202與二聚體PD-L1蛋白的相互作用。BMS-202位於PD-L1同型二聚體的核心，填充了一個較深的疏水性口袋，其橫截面具有類似圓柱形的形狀。結合模式表明甲氧基和尾基之間有很大的空間（在A中用紅色圓圈突出顯示），可以被適當的5元或6元環佔據。這表明在此位置的環融合策略具有一定的可行性。因此，研究人員隨後設計併合成了一系列基於萘的PD-1/PD-L1抑制劑（N1-N17）。
萘類衍生物N1-17的生化評價.
所有的萘類衍生物IC50值均大於10μM，表明萘骨架可能不是最佳設計。
化合物N9的分子對接結果顯示，N9的N-（2-氨乙基）乙醯胺尾基與Asp122和Lys124形成氫鍵相互作用。其中，N9的NH部分與ASP122的羥基形成氫鍵；而BMS-202的NH部分與ASP122的羥基和羰基部分形成兩個氫鍵，這表明抑制劑的親水性尾部所產生的氫鍵相互作用的方向會強烈影響抑制劑的結合親和力。
為了進一步優化活性。研究者首先進行了分子建模/對接，以探索最近報導BMS-1001和BMS-1166的結合模式。BMS-1166和BMS-1001的尾基與二聚體PD-L1蛋白具有強相互作用。同時，苄基氰化物部分的引入還通過與ARG125形成氫鍵來增強與PD-L1蛋白的相互作用。此外，圖中的白色圓圈突出顯示了尾部基團與二聚體PD-L1蛋白之間的較大空間，該空間可能被適當的環或鏈佔據。基於這些考慮，研究人員設計了系列具有各種尾基的PD-1/PD-L1抑制劑（化合物NC和NP系列）。
化合物NC1- 12的生化評價.
帶有胺基酸、短鏈、四元環的NC1，NC5、NC6顯示出最佳的抑制活性。該部分SAR表明，可以通過修飾尾部取代基來調節小分子抑制活性。因此隨後研究者著重於修飾具有不同小環和胺基酸的尾基，還探索了引入2,3-二氫-1,4-苯並二氧雜基部分對於抑制活性是否重要。
化合物NP1- 25的生化評價.
大多數NP化合物IC50值在納摩爾範圍（10-100 nM）。表明各種尾基，例如胺基酸、小環、氮雜環丁烷具有良好的耐受性。同時，2,3-二氫-1,4-苯並二氧雜基部分的引入對不同化合物的活性具有不同的影響。
化合物NT1- 22的生化評價.
接下來，研究者通過使用各種雜環（化合物NT系列）取代聯苯部分進行進一步的修飾，以研究聯苯部分對活性是否重要。結果表明，大多數NT化合物都具有較高的抑制活性，IC50值在納摩爾範圍內。當用各種雜環（如吡啶和嘧啶）取代聯苯部分的末端苯基時，抑制活性有所下降（IC50>100 nM），這表明疏水聯苯對於高活性至關重要。
SAR總結
結構修飾的位點主要集中在六個區域上。在區域1中，可以應用環融合策略，但是環的大小對結合親和力有很大的影響。在區域2中，基於萘骨架設計了一系列化合物，但所有化合物的活性均急劇下降。然而，瀋陽藥科大學的研究人員發現了三唑並吡啶類衍生物具有相對較高的活性（例如，A22，IC50 = 92.3nM），表明其方向和稠合環的大小可能會影響結合親和力。在區域3中，醯胺連接基不是優選的，而喹啉環可以保留其活性。在區域4中引入吡啶甲腈或苯甲氰可以顯著提高抑制活性。在區域5中用喹喔啉基團取代末端苯基部分活性提高，表明疏水性聯苯有利於抑制活性。在區域6中，將哌啶環引入尾部取代基活性下降，表明親水性尾部取代基最適合與PD-L1結合。
基於上述SAR，研究人員發現小的結構修飾可導致活性的急劇變化，表明小分子抑制劑與PD-L1蛋白質結合的精確性和複雜性。
NP19對IFN-γ產生的體外效力.
阻斷PD-1 / PD-L1相互作用可以增強T細胞增殖和IFN-γ分泌。因此，研究人員使用腫瘤/T細胞共培養測定法評估NP19對IFN-γ產生的影響。結果表明，化合物NP19以劑量依賴性方式顯著提高了IFN-γ的產生。在NP19 10μ濃度下，IFN-γ分泌增加了160％。
NP19的體內PK
在SD大鼠中，NP19的口服半衰期較長，然而口服生物利用度較低，需要高劑量才能提供足夠的藥物濃度以實現抗腫瘤功效。
NP19在B16-F10黑色素瘤模型中抗腫瘤功效
在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中，通過灌胃給藥三個劑量NP19（25, 50, 100mg/kg），其腫瘤抑制效果明顯優於陽性對照，並且沒有觀察到嚴重的毒副作用。
NP19在H22肝細胞癌模型中的抗腫瘤功效
在BALB/c小鼠的H22肝細胞癌模型中，腹腔注射NP19。其顯示了明顯的抗腫瘤活性，且沒有觀察到明顯的體重減小。
NP19顯示減弱的體外抗小鼠PD-1/PD-L1活性
NP19對小鼠PD-1/PD-L1相互作用的抑制作用要弱得多。從人PD-1/PD-L1結合檢測過渡到小鼠PD-1/PD-L1結合檢測時，活性損失>80倍。但值得注意的是，NP19在兩種不同的小鼠腫瘤模型中均顯示出顯著的體內抗腫瘤功效，同時，在體外具有較高的抗人PD-1 / PD-L1活性，這表明NP19在抑制人類腫瘤生長方面可能更有效。
NP19通過激活小鼠免疫微環境抑制腫瘤生長
NP19在10μM的濃度下對人非小細胞肺癌細胞系A549、小鼠黑素瘤細胞系B16-F10三種細胞系沒有顯示明顯的抑制作用，表明NP19沒有直接的細胞毒性作用。
臨床研究表明，PD-L1的表達是使用PD-1/PD-L1抑制劑後治療應答及結果的預測指標，PD-1 / PD-L1抑制劑的治療效果與PD-L1表達之間存在正相關。與陰性對照組相比，mAb治療組的PD-L1蛋白陽性率為16.2％。PD-L1蛋白的高表達水平與NP19在患有黑色素瘤的BALB/c小鼠中的高抗腫瘤功效密切相關。
此外，腎臟和肝臟的H＆E染色表明NP19對黑色素瘤小鼠的主要器官沒有明顯的毒副作用。黑色素瘤腫瘤組織的H＆E染色還顯示，在NP19治療組中觀察到大量的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）（紅色箭頭突出顯示），表明已向活化的免疫微環境轉變，而非轉向免疫抑制微環境。
此外，在經過NP19處理的三種黑色素瘤腫瘤組織中，25 mg / kg劑量下，輔助性T細胞的百分比高於陽性對照（P <0.05）。50 mg / kg或100 mg / kg NP19處理後，腫瘤組織中活化的細胞毒性T細胞百分比顯著高於陽性對照（P <0.05）。
在脾組織中，NP19治療組和對照組中輔助性T細胞和活化的細胞毒性T細胞的百分比無顯著差異。低劑量（例如25 mg / kg）的NP19可以激活輔助性T細胞，而高劑量（≥50mg/ kg）的NP19可以激活TIL中的細胞毒性T細胞。
綜上，NP19的抗腫瘤活性與腫瘤微環境的調節有關，並與腫瘤浸潤淋巴細胞的數量增加有關。
總結
PD-1 / PD-L1單克隆抗體已經取得了巨大成功，但是小分子PD-1 / PD-L1抑制劑的開發仍處於起步階段，因為迄今為止發現的大多數化合物仍處於臨床前階段。小分子PD-1 / PD-L1抑制劑可能具有與mAb不同的藥代動力學和藥效學特徵，但是設計該類小分子仍頗具挑戰，因為PD-1和PD-L1之間的界面是疏水、平坦且延伸的（約1.700）。疏水界面也可能導致假陽性結果。此外，小分子PD-L1抑制劑可能是疏水性分子，可能導致毒性及不良的藥代動力學性質。
因此，發現新的PD-1 /PD-L1抑制劑的未來方向將集中在改善藥代動力學特性和毒性方面。
參考文獻
Binbin Cheng, etal. Discovery of Novel Resorcinol Dibenzyl Ethers Targeting the Programmed CellDeath-1/Programmed Cell Death–Ligand 1 Interaction as Potential AnticancerAgents. J. Med. Chem.2020,63, 15, 8338–8358.