自從超高解析度螢光顯微鏡成像技術斬獲了2014年諾貝爾化學獎以後，螢光成像技術飛速發展。尤其是近些年來，科學家將顯微鏡的解析度從幾百納米提高到了幾十納米，為生命科學研究提供了一個強大而有力的工具，從而讓我們能夠以一個全新的視角觀察奇妙的生物微觀世界。例如，存在於我們體內的細菌群落在人類健康和生物學中起著重要作用，而且這些微生物種類繁多。但是這些微生物是如何起作用？它們之間又是如何在功能上相互作用？這些問題都不得而知。
圖1. 人舌頭表面的微生物群落。
2020年3月24日，《Cell reports》期刊上刊登了哈弗大學牙科醫學院Borisy等人的研究成果----一張「人舌頭表面的微生物群落」圖。研究發現，舌頭上的細菌不是隨機堆積的，它們其實有著非常複雜、高度結構化的空間組織。用文章作者Borisy的話來說：它們就像是我們的身體器官。在該工作中，研究人員使用了實驗室開發的組合標記和光譜成像-螢光原位雜交（CLASI-FISH）技術，這項技術包括用多個螢光團標記給定類型的微生物，極大地擴展了單一視野下同時識別和定位的不同種類微生物的數量。
這項工作的創新在於，以前沒有人能夠以區分所有不同細菌的方式來觀察舌頭上的生物膜，可視化它們如何排列自己。以前大多數關於細菌群落的研究僅基於DNA測序，但是要獲得DNA序列，首先得研磨樣本提取DNA，這會破壞細菌群落神奇的空間結構。而利用CLASI-FISH技術成像，可以在保留空間結構的同時識別細菌。
遺憾地是，雖然光譜成像和螢光原位雜交技術的組合，可以區分在同一圖像中捕獲的15種和120種不同類型的微生物，但是這些技術的缺點是需要大量螢光標記探針。
突破！HiPR-FISH新技術可識別並創建數百種微生物的位置和特性空間圖
近日，康奈爾大學Shi Hao 和Iwijn De Vlaminck等人通過將新型探針設計與自定義圖像分析相結合，開發了一種超越先前FISH基準的技術---通過螢光原位雜交進行的高系統發育解析度微生物組定位（HiPR-FISH），以創建數百種甚至數千種不同微生物物種的位置和特性的複雜空間圖。研究人員將該技術應用於小鼠腸道微生物組和人類口腔菌斑微生物組兩個不同的系統，成功獲得了相應的微生物群結構圖譜。該工具將幫助科學家了解複雜的微生物群落如何相互作用以及它們的環境（也就是我們的身體）。相關研究以「Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities」為題，發表在《Nature》上，Shi Hao 為文章的第一作者兼通訊作者，康奈爾大學Iwijn De Vlaminck教授為共同通訊作者。
如何識別並定位微生物群落
要點一：為了定位微生物群落，研究人員設計了一種被稱為編碼探針的DNA探針，使其與目標細菌的物種特異性序列（16S核糖體RNA）相匹配。該編碼探針的兩側是探針的組成部分，稱為讀出序列，每個讀出序列被融合到對特定讀出序列具有特異性的螢光團的另一個DNA探針靶向。由於細菌細胞包含數百個16S rRNA複製片段，因此每種細菌都可以通過一系列編碼探針來靶向：每種靶向相同的RNA序列，但側翼為不同的讀出序列對，從而可以關聯多種讀出序列與特定的物種（圖2）。
圖2. HiPR-FISH技術以高空間解析度識別1000多種細菌的組合策略。
要點三：根據所使用的編碼探針，每種細菌物種最多可以結合十種可能的螢光團。這樣一來，該技術便可以「繪製」總共1,023種大腸桿菌的色彩組合（圖3d），每種顏色都用獨特的二進位條形碼進行螢光標記。以識別單個細菌種類。
要點四：隨後使用共聚焦顯微鏡用雷射點亮螢光標記，可以通過光譜成像監控和使用機器學習算法對圖像中的微生物進行分類，可以同時解碼細菌身份 （圖3g）。HiPR-FISH通過將編碼序列簡化為廉價合成的DNA序列，並且僅需要十種不同類型的螢光團，從而產生了一種具有單細胞解析度的高效且經濟高效的技術。
圖3. HiPR-FISH技術的工作原理圖。
Shi和同事使用自動程序描繪密集人群中的大量單個細胞，使用HiPR-FISH定位，確定小鼠腸道樣品和人類口腔微生物樣品中單個細菌的種類，並繪製了它們的空間圖。
圖4. 人口腔的微生物群落空間圖。
Iwijn De Vlaminck教授稱：這種使用單細胞水平圖譜對複雜群落進行分析，使得定量研究細菌的空間組織成為現實，例如確定宿主中特定微生物物種之間的距離。通過闡明微生物的生物地理學，這項工作為探索複雜生態系統中的微生物相互作用提供了新的途徑。這對於回答有關微生物群落行為的關鍵問題非常重要，例如，微生物群之間互動以及這些互動是如何發生的，對宿主有何影響。因此，HiPR-FISH技術通過對複雜社區中數百種微生物之間的空間距離進行微米級的製圖，開啟了微生物生態學研究的新紀元。
此外，空間作圖可能是研究並可能治療以細菌為主要罪魁禍首的一系列疾病的重要工具，例如炎症性腸病，結腸直腸癌和感染。「我們想更深入地研究微生物群在其中發揮重要作用的系統的生物學，並試圖了解當您患上疾病時這些空間動態如何變化，」 文章的第一作者Hao Shi說。 「我們想看看是否能提供任何線索和治療見解，我們可以利用它們來幫助人們。」
參考文獻：
Shi, H., Shi, Q., Grodner, B. et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2983-4
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2983-4
來源：高分子科學前沿