Cell Res:楊茂君研等闡明生物體攝取鎳鈷等金屬離子的機制

2013年12月24日，清華大學生命學院楊茂君研究組在《自然》系列雜誌《Cell Research》上在線發表了學術論文「Planar substrate binding site dictates the specificity of ECF-type nickel/cobalt transporters」（底物平面結合位點決定了鎳/鈷能量耦合轉運蛋白的底物特異性）。文章首次報導了鎳/鈷轉運複合體中底物識別蛋白NikM的高分辨晶體結構，並通過生物化學、細胞生物學、生物物理學，量子化學及計算生物學等手段系統地闡明了此類蛋白質複合物家族在底物識別及轉運等過程的分子機制，為理解微生物在維生素B12的合成過程中鈷離子的攝取提供了新的視點。清華大學生命科學學院楊茂君為本論文的通訊作者，清華-北大-NIBS三校聯合二年級研究生於遊為第一作者，清華大學生命科學學院博士研究生周明澤，張麗參與了該研究工作。德國柏林洪堡大學的Thomas Eitinger教授以及清華大學化學系李雋教授及上海同步輻射光源姜政教授實驗室成員也參與了該項研究。

從環境中吸收痕量存在的鎳/鈷離子對微生物的存活至關重要，已知ECF（energy coupling factor）轉運體是分布最廣的鎳/鈷離子的主動運輸轉運體。ECF可從底物類別上可以分為兩大類，一類是維生素類ECF轉運體，其底物識別蛋白可以特異性的結合相對應的維生素。另一類是離子類ECF轉運體，其底物識別蛋白可以特異性識別相對應的金屬離子。現已知有多個維生素類ECF底物識別蛋白的結構得以解析，相關識別和轉運機制也研究的比較清楚。但是，目前為止，還沒有離子類ECF底物識別蛋白的結構信息，同時，其特異性識別鎳/鈷離子的分子機制也亟待闡明。楊茂君研究組通過晶體結構生物學手段，解析了第一個離子類ECF轉運體底物結合蛋白NikM的1.83埃的分子結構，從分子水平上闡釋了NikM特異性識別鎳/鈷離子的機理。分子結構提示NikM的N端九個胺基酸形成的loop區對其特異性的識別鎳/鈷離子具有至關重要的作用，此loop區可與周圍胺基酸形成了有方向性的氫鍵網絡，以穩定結合鎳/鈷離子時的分子構象，同時Met1，His2和His67直接參與了鎳/鈷的結合，形成了平面四配位底物結合位點（圖A，B）。體外XANES（K-edge X-ray absorption near-edge structure）實驗揭示了即使在溶液狀態下，NikM也是通過平面四配位的底物結合位點識別鎳/鈷離子（圖C）。放射性同位素Ni63標記的體內轉運實驗闡明，N端loop區的氫鍵網絡對鎳/鈷的轉運活性具有必不可少的作用（圖D）。基於高解析度結構的量子化學計算發現NikM對存在3d軌道雜化的過渡金屬離子具有更強的結合能力，且其中以鎳和鈷最強，進而提出了NikM的底物如何被特異性識別的機制。

楊茂君研究組從2010年起，針對鎳/鈷等過渡金屬離子的轉運做了系統的結構和生化研究。並於2013年10月在《Protein & Cell》上發表了學術論文「Structural basis for a homodimeric ATPase subunit of an ECF transporter.」（一類能量耦合轉運蛋白ATPase同源二聚體的結構研究）。首次發現離子類ECF的ATP結合蛋白存在同源二聚並可能受到維生素B12合成過程中間產物調節的現象，為鎳/鈷離子的轉運機制的研究提供了重要線索。

上海同步輻射光源(SSRF)BL17U1，BL14W1和北京同步輻射光源（BSRF）4W1B等線站為數據收集提供了及時有效的支持。該系列研究獲得科技部重大研究計劃、國家自然科學基金委重點項目及清華-北大生命聯合中心的支持。(生物谷Bioon.com)

生物谷推薦的英文摘要：

Cell Research   doi：10.1038/cr.2013.172

Planar substrate-binding site dictates the specificity of ECF-type nickel/cobalt transporters

You Yu1，2， Mingze Zhou1，2， Franziska Kirsch3， Congqiao Xu4， Li Zhang1，2， Yu Wang5， Zheng Jiang5， Na Wang1，2， Jun Li4， Thomas Eitinger3 and Maojun Yang1，2

The energy-coupling factor (ECF) transporters are multi-subunit protein complexes that mediate uptake of transition-metal ions and vitamins in about 50% of the prokaryotes， including bacteria and archaea. Biological and structural studies have been focused on ECF transporters for vitamins， but the molecular mechanism by which ECF systems transport metal ions from the environment remains unknown. Here we report the first crystal structure of a NikM， TtNikM2， the substrate-binding component (S component) of an ECF-type nickel transporter from Thermoanaerobacter tengcongensis. In contrast to the structures of the vitamin-specific S proteins with six transmembrane segments (TSs)， TtNikM2 possesses an additional TS at its N-terminal region， resulting in an extracellular N-terminus. The highly conserved N-terminal loop inserts into the center of TtNikM2 and occludes a region corresponding to the substrate-binding sites of the vitamin-specific S components. Nickel binds to NikM via its coordination to four nitrogen atoms， which are derived from Met1， His2 and His67 residues. These nitrogen atoms form an approximately square-planar geometry， similar to that of the metal ion-binding sites in the amino-terminal Cu2+- and Ni2+-binding (ATCUN) motif. Replacements of residues in NikM contributing to nickel coordination compromised the Ni-transport activity. Furthermore， systematic quantum chemical investigation indicated that this geometry enables NikM to also selectively recognize Co2+. Indeed， the structure of TtNikM2 containing a bound Co2+ ion has almost no conformational change compared to the structure that contains a nickel ion. Together， our data reveal an evolutionarily conserved mechanism underlying the metal selectivity of EcfS proteins， and provide insights into the ion-translocation process mediated by ECF transporters.