Illumina Hiseq/Miseq測序原理

2020-10-18 remax520

一、Solexa測序技術前世今生（——Illumina平臺）

Solexa高通量測序技術是由英國劍橋大學派生的Solexa公司建立起來的。該方法以單分子陣列技術為基礎，是對合成測序技術的發展與延伸。

二、測 序 原 理

Solexa是一種基於邊合成邊測序技術（Sequencing-By-Synthesis，SBS）的新型測序技術。通過單分子陣列實現在小型晶片（FlowCell）上進行橋式PCR反應。通過可逆阻斷技術實現每次只合成一個鹼基，再利用相應的雷射激發螢光集團，捕獲激發光，從而讀取鹼基信息。

1）Flow Cell結構

2）可逆阻斷技術


3）邊合成邊測序（SBS）


a.加入測序引物 

Cycles1 

    a)合成第一個鹼基 

    b)清除未反應的鹼基和試劑 

    c)激發螢光信號並讀取 （可逆阻斷技術步驟）

    d)去除螢光基團和阻斷基團 （可逆阻斷技術步驟）

Cycle2……Cycle n

4）橋式PCR（——簇生成之「起始延伸」）


5）橋 式 PCR（——簇生成之「擴增」） 


6）橋 式 PCR（——簇生成之「測序」）

7）鹼基讀取



三、工作流程


四、測 序 類 型

a)單端測序（single-read sequencing，SR） 

b)雙端測序（Paired-endsequencing，PE） 

c)混樣測序（Indexsequencing）

1）FollowCell 接頭差異


Paired End

Uracil Specific Excision Reagent (USER)

尿嘧啶切割位點

FormamidopyrimidineGlycosylase (fpg)

糖基化酶切割位點


Single Read

Periodate Linearization

高碘酸鹽切割位點

a）雙 端 測 序

Paired-End sequencing（PE/雙端測序） 

−檢測基因片段兩端的基因信息。


b）單 端 測 序

Single-read sequencing（SR，單端測序） 

−只檢測基因片段一段的基因信息。


c）混 樣 測 序

Index Sequencing：將多種樣本混合測序 

−充分利用solexa高通量測序特點。


A：Adapter

B：Fragment DNA

C：Index seq primer

D：Index

E：Adapter


五、儀 器 構 造


六．測序結果展示

Fastq：Fastq是Solexa測序技術中一種反映測序序列的鹼基質量的文件格式。

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