東風吹，戰鼓擂，二代三代誰怕誰
小編作為生信人，還沉浸在illumina的paired-end中，突然發現，我國已成為迄今以及將來的全球最大三代測序平臺擁有國，深感焦慮啊。如果不了解些三代測序的知識，將來如何在生信圈立足呢？本著好東西要和好朋友分享的態度，小編整理了最近get到的一些三代測序知識點，首先是QC篇。
1下機數據
小編選擇了一個cell的下機數據為例進行介紹，不多說，先上圖:
在analysis文件夾中，下機的數據被分割為三個文件進行存儲，其中以bax.h5為後綴的是原始二進位文件；以subreads.fasta/subreads.fastq 為後綴的是經一級處理得到的標準格式的鹼基文件；以sts.csv/sts.xml為後綴的是記錄測序過程中每個ZMW度量指標的統計文件。
在這裡，小編還仔細查看了下機數據的命名，發現其中也有著固定的規律，且看小編細細道來：
這裡解釋一下：
1. m是movie的縮寫；
2. 測序時間，格式為yymmdd_hhmmss；
3. 儀器編號；
4. SMRT Cell Barcode；
5和6無實際意義，一般是固定的。
2數據結構
要做好數據的質控，不僅要知其然，還有知其所以然。首先小編展示的是三代數據的文庫模型：
三代測序的文庫模型是兩端加接頭的啞鈴型結構，測序時會環繞著文庫進行持續的進行，由此得到的測序片段稱為polymerase reads,即一條含接頭的測序序列，其直觀的反映了三代測序的長度。目前，採用最新的P6-C4酶，最長的讀長可達到60kb以上。
在這裡，大家可能會有疑問，環繞測序豈不是產生了很多冗餘的信息？其實，這裡的polymerase reads是需要進行一定的處理才能獲得用於後續分析的。這個過程首先是去除低質量序列和接頭序列：
Polymerase reads 經處理後得到的序列稱為subreads ，根據不同插入片段長度的文庫， subreads 的類型也有所不同。
在用於基因組denovo時，通常會構建10kb/20kb的文庫，對長插入片段文庫的測序基本是少於2 passes的(pass即環繞測序的次數)，得到的reads也稱為Continuous Long Reads (CLR)，這樣的reads測序錯誤率等同於原始的測序錯誤率。
而對於全長轉錄組或全長16s測序，構建的文庫插入片段較短，測序會產生多個passes，這時會對多個reads進行一致性校正，得到一個唯一的read,也稱為Circular Consensus Sequencing (CCS) Reads，這樣的reads測序準確率會有顯著的提升。
3數據質控
不同於二代測序的鹼基質量標準Q20/Q30，三代測序由於其隨機分布的鹼基錯誤率，其單鹼基的準確性不能直接用于衡量數據質量。那麼，怎麼判斷三代測序的數據好不好呢？
最直接的方法是看長度。長度短的測序數據不一定差（與文庫大小有關），但差的數據長度一定短。在上遊測序，最關鍵的影響因素是文庫的構建。高質量的文庫產出的數據長度長，質量好；而低質量的文庫產出的數據長度短，質量差。
其次，看比例。需要關注的是兩個比例，一個是subreads與polymerase reads數據量的比例，比例過低反映測序過程中的低質量的序列較多；一個是zmw孔載入的比例，根據孔中載入的DNA片段數分為P0、P1和P2。P1比例過低反映數據產量低，P2比例過高反映上樣濃度異常。
結語
對於測序，小編認為不管一代二代三代，還是要落實到能夠解決實際問題。測序數據類型和格式會變，而數據分析背後的原理不會變。當然，紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行，小編也歡迎大家分享關於三代測序數據處理方面的經驗。
PS: 本文相關介紹均以Pacbio RSII測序平臺的數據為準，與Sequel測序平臺略有出入，如有舉報，概不接受 ~_~