RNA病毒檢測(RT-qPCR法)(新冠病毒研究推薦)

2020-11-09 DY締一生物

許多病毒都是RNA病毒,如新型冠狀病毒。國際上通行的檢測方法是RT-qPCR方法。這就離不開RT-qPCR mix。下面給您介紹的這款Mix值得關注,因為它可用於新冠病毒研究檢測(不用於診斷),是其中的一個重要組分。

一、用途

RNA病毒檢測試劑盒(RT-qPCR法)(英文名:ConviFlex™RT-Taq mix)用於定性檢測和分析RNA病毒和RNA分子,特別適合檢測新冠病毒等此類病毒。

二、描述:

1.該試劑盒為實時定量qPCR(RT-qPCR)RNA病毒檢測試劑盒。

2. 試劑盒由兩種組分組成:

組分1. ConviFlex™ RT-Taq Mix的凍乾粉包含:MuLV逆轉錄酶、Taq聚合酶及dNTP。

其中MuLV逆轉錄酶,來自小鼠白血病病毒(M-MuLV)並經過基因修飾。

這裡的Taq聚合酶另兼具熱啟動功能。

此Taq酶在室溫下,活性被抗體所抑制,當溫度達到70°C以上時,才會被完全激活。

在70°C 以下時,由於Taq酶沒有完全活化,因此實驗不會產生非特異性PCR產物和引物二聚體。熱啟動Taq酶的使用可使PCR具有更高的特異性和靈敏度。

3. 試劑盒使用時,先用復溶緩衝液溶解凍乾粉,再加入自備的RNA模板和引物。

推薦使用MB公司提供的新冠病毒的引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm,貨號271-2100)

4. 該試劑盒適合大多數RT-qPCR體系和qPCR儀類型。關於實驗使用的最佳體積、濃度、溫度和孵育時間,本文有相應的建議,但實驗室仍可依據自己的分析要求作相應調整。

三、產品特點:

1. 凍乾粉為逆轉錄酶和Taq酶的預混液,將RNA逆轉錄與qPCR擴增兩個過程合併,一步完成,減少移液次數、避免交叉汙染、操作簡單,節約時間。

2. Taq酶具有70°C熱啟動功能,顯著提高試劑盒的特異性和敏感度。

3. 主要組分為凍乾粉,4℃保存,儲存運輸方便,性能穩定。

四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器:

1. 引物、探針(可選)

推薦MB公司提供的新冠病毒的引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm,貨號271-2100)

2. 螢光定量PCR儀(qPCR儀)

3. 無DNase和RNase的qPCR反應管

4. 離心機

5. 移液器及帶濾芯吸頭(不含DNase和RNase)

6. 用戶自己的樣品。

五、樣本製備說明:

1. 來自於真核細胞、原核細胞、病毒的RNA以及體外轉錄的RNA,均可用於檢測。

2. 製備的RNA必須不含RT-qPCR抑制劑,例如有機溶劑等。

3. 儘量減少RNA樣品的凍融次數,同時避免RNA酶汙染,以減少RNA降解的風險。(RNA降解會極大地限制了RT-qPCR反應的性能)

4. 樣本製備過程中,注意避免其他DNA的汙染,DNA的幹擾也會降低qPCR的準確性。

建議採用商品化的RNA提取試劑盒預先處理待檢物(如拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌),例如MB廠家的:

【RNA小提試劑盒】(英文名:ExtractNow™ RNA Mini Kit,貨號603-1050)

【病毒RNA提取試劑盒】

(英文名:ExtractNow™ Virus RNA Kit, 貨號611-1010/-1050/-1250)

或使用其他已建立的方法。

六、操作注意事項:

該試劑盒應僅由經過培訓的實驗室人員使用。始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。

根據樣品類型,應謹慎處理所有樣品。該試劑盒不含有害物質。殘餘物可以根據當地法規丟棄。

七、操作步驟

步驟1. 凍乾粉ConviFlex™RT-Taq Mix,最大速離心5秒鐘,然後加入260μl復溶緩衝液2×Rehydration Buffer,室溫靜置5分鐘後,渦旋並離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。

步驟2. 每個反應體系為20µl,其中反應mix為15µl。

(1)依據本次試驗樣本數,製備RT-qPCR的反應mix。

1個反應mix需要:

①ConviFlex™ RT-Taq Mix(即上面復溶的預混液)10µl,

②引物(濃度0.1 - 0.5 µM)

③探針(濃度0.1 - 0.5 µM)

④PCR級水(使每管總體積為15µl)

註:引物和探針的推薦濃度範圍是0.1-0.5 μM。

通常,引物濃度過高,會增加引物錯配和非特異RT-PCR產物。然而,當RT-PCR程序運行時間較長或使用簡併引物時,則推薦引物濃度升高至1 μM。(注意:若使用簡併引物,同一RT-PCR分析中,引物之間應具有相同的熔解溫度)

(2)將反應mix渦旋並離心5秒鐘。

(3)每個PCR管中加入15μl反應mix和5μl樣本(抽提後的RNA),

或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩衝液,作為陰性對照,或5μl PCR級水作為無模板對照,或5μl陽性對照。

(4)扣緊PCR管,然後短暫離心。

(5)將PCR管放置qPCR儀上,蓋好蓋。

步驟3. 在qPCR儀上設置反應程序,

示例: 1 cycle 50 °C for 20 min

1 cycle 95 °C for 10 min

45 cycles 95 °C for 15 sec

60 °C for 1 min

(以上程序僅依據廠家經驗,用戶可根據實際情況調整溫度和孵育時間)

步驟4. 啟動程序

八、使用注意事項:

1. 使用前應認真閱讀說明書。

2. 來自不同批次的試劑不能混合。

3. 試劑盒內的試劑應始終作為一個整體溶解分裝。

4. 試劑盒應在效期內使用。

5. 每次PCR至少應設置一個陽性對照。每次PCR至少應設置一個陰性對照和/或一個無模板對照。如果實驗者自己抽提RNA,則可使用洗脫緩衝液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實驗室提供的對照品,例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照,對於確認結果的可靠性或用於排除故障非常有意義。

6. 建議在無RNA和DNA汙染的條件下進行RT-PCR,以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉汙染。(MB公司推薦使用PCR汙染祛除噴霧,英文名:PCR Clean™,貨號15-2025,預先清潔實驗環境。)

7. RNA模板濃度,應依據提取RNA的質量、來源、感興趣基因的相對豐度、以及是否為低拷貝基因,來調整優化。

8. 該試劑盒建議逆轉錄步驟的溫度為50°C。但這個溫度及持續時間可根據實驗室自己的分析要求進行優化,以增強反應的性能。

相關焦點

  • 韓新冠病毒檢測法30分鐘出結果
    韓新冠病毒檢測法30分鐘出結果科技日報首爾10月28日電 (記者邰舉)韓國學者日前研發成功一種新的快速核酸檢測技術,可用於新冠病毒檢測。據介紹,該技術普通人可以操作,並在30分鐘內獲得結果。韓國浦項科技大學日前發布科研新聞稱,該大學化學工程系李正旭教授、吳昌河博士研究組和鄭圭烈教授、張成浩博士研究組組成的聯合研究小組研發成功一種使用核糖核酸序列檢測新冠病毒的「SENSR」技術。使用這一技術可以在30分鐘內檢測出人們是否感染病毒,最大限度減少感染者的接觸人數。「SENSR」技術製作的檢測試劑盒可由普通人操作。
  • 新冠病毒檢測走向「物美價廉」
    這類方法相當準確,但某些處於感染極早期的人或由於實驗室錯誤,會產生假陰性結果(檢測結果顯示未感染病毒,但實際上感染了)。這類技術很少出現假陽性(檢測結果顯示感染了病毒,而實際上未感染)。因此,如果PCR測試表明某人已感染,那麼他們很可能的確攜帶該病毒。當然,這一方法並非完美無缺,主要缺點是速度慢——通常需要幾天才能獲得結果。
  • 新冠病毒核酸檢測到底檢測了啥?
    新冠疫情發展至今,已成全球之勢,中國的疫情基本已得到控制,亦有能力幫助其他國家,援助各種醫療資源,例如醫護人員、口罩、檢測試劑、呼吸機等。而3月23日,西班牙媒體報導了一則「西班牙衛生部購買了新冠病毒快速檢測假試紙」的新聞,其中西班牙一家試驗室聲稱其從中國購買的新冠病毒快速檢測試劑有效率僅為30%,跟宣稱的80%準確率相去甚遠。在這風口浪尖,還有企業敢賣假貨?
  • 澳發明20分鐘新冠病毒血液檢測方法
    本文轉自【科技日報】;科技日報北京7月20日電 (記者劉霞)據美國《每日科學》網站近日報導,澳大利亞科學家發明了一種簡單的新冠病毒檢測新方法,可在約20分鐘內,使用血液樣本檢測出某人是否感染了新冠病毒。
  • 支原體螢光定量試劑盒(qPCR法)介紹
    螢光定量PCR法(qPCR):是在常規PCR基礎上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做螢光標記,使PCR擴增後的產物帶有螢光,利用螢光信號的變化和配套軟體,進行DNA擴增反應的實時監測,簡稱qPCR。本文第締一生物為您做支原體螢光定量試劑盒(qPCR法)介紹。
  • 澳研究稱廢水檢測有助於更早發現新冠病毒
    (新華社/路透)新華社坎培拉12月11日電(記者嶽東興 白旭)澳大利亞聯邦科學與工業研究組織10日發布公報說,他們與昆士蘭大學科研人員開展的新研究表明,廢水檢測可在新冠病毒感染者出現症狀幾周前就發現社區中存在的
  • 新方法可檢測血液中是否存在新冠病毒抗體
    英國《自然·醫學》雜誌12日公開的一份免疫學研究論文,美國科學家介紹了一種可以檢測新冠肺炎患者血液中是否存在新冠病毒抗體的方法。這種方法已經在16名患者身上做過測試,或有助於鑑定出血漿中包含病毒抗體的個體,這種抗體有望用於治療其他病人。
  • 澳大利亞新研究稱廢水檢測有助更早發現新冠病毒
    澳大利亞聯邦科學與工業研究組織10日發布公報說,他們與昆士蘭大學科研人員開展的新研究表明,廢水檢測可在新冠病毒感染者出現症狀幾周前就發現社區中存在的新冠病毒,有助於構建有針對性的早期檢測系統。研究人員回顧分析了今年2月和3月初在澳大利亞布裡斯班收集的廢水樣本。研究發現,最早在當地公開報告首批新冠病例之前三周,就已能從廢水樣本中檢測到新冠病毒的基因指紋。研究成果近日已發表在美國《整體環境科學》雜誌上。
  • 《細胞》:激酶是潛在的新冠病毒藥物靶標
    全球新冠肺炎疫情持續惡化,確診病例已經超過1000萬,整個科學界都在急切地尋找有效的抗病毒療法。一個國際研究小組近日在《細胞》雜誌上發表研究論文指出,激酶是潛在的新冠病毒藥物靶標,一些針對激酶活性的藥物可以抑制病毒感染。研究人員稱,他們已確認了數種具有抗病毒作用的激酶藥物,希望有關人員能儘快對其進行臨床測試。
  • 澳研究稱廢水檢測有助更早發現新冠病毒
    來源:新華網新華社坎培拉12月11日電(記者嶽東興 白旭)澳大利亞聯邦科學與工業研究組織10日發布公報說,他們與昆士蘭大學科研人員開展的新研究表明,廢水檢測可在新冠病毒感染者出現症狀幾周前就發現社區中存在的新冠病毒,有助於構建有針對性的早期檢測系統。
  • 張鋒團隊推出新冠病毒CRISPR檢測技術
    Broad研究所的著名學者張鋒教授和他在Broad研究所,麻省理工學院(MIT)麥戈文腦科學研究所(McGovern Institute for Brain Research)的合作夥伴一起,公布了他們開發的新一代新冠病毒CRISPR檢測技術的實驗流程。
  • ...出活的新冠病毒,並且在隔離房間的物體表面上檢測到新冠病毒RNA
    在第一項新的研究中,來自中國中山大學、廣州醫科大學、中國科學院和廣州海關技術中心的研究人員(下稱第一組中國研究人員)從病死患者的糞便中分離出了活的SARS-CoV-2病毒。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)在1月27日至2月7日收集的4份糞便樣本中檢測到SARS-CoV-2 RNA。從活檢樣本中採集的胃腸道表面細胞上也發現了這種病毒的抗原。該患者於2月20日死亡。症狀出現後17~28天收集的的糞便樣本中病毒DNA含量高於呼吸道樣本。
  • 美國FDA緊急授權:通過唾液樣本檢測新冠病毒
    川普所說的這一檢測方法,由羅格斯大學旗下的人類遺傳研究所(RUCDR infinite Biologics)與光譜解決方案(Spectrum Solutions)聯合精確診斷實驗室(Accurate Diagnostic Labs)合作開發,已經獲得了美國食品藥品監督管理局(FDA)的緊急使用授權,預計於4月15日起投入使用 [2]。
  • 廢水檢測有助早發現新冠病毒
    據新華社坎培拉12月11日電 (記者嶽東興 白旭)澳大利亞聯邦科學與工業研究組織10日發布公報說,他們與昆士蘭大學科研人員開展的新研究表明,廢水檢測可在新冠病毒感染者出現症狀幾周前就發現社區中存在的新冠病毒
  • 35分鐘可精確檢測新冠病毒!日本研發最新型檢測系統
    來源:海外網圖源/朝日新聞【海外網3月30日|戰疫全時區】日本長崎大學日前與佳能旗下子公司佳能醫療系統共同研發出新型基因檢測系統,只需35分鐘即可檢測出新冠病毒。據日本《朝日新聞》報導,該系統可在35分鐘內檢測出新冠病毒,與現行的PCR檢測(4小時)相比,極大縮減了檢測時間。由於該系統檢測準確度高,自26日起已投入使用。進行病毒檢測,首先需要從咽喉和鼻腔裡採取檢本,再提取其中的病毒基因進行培養,直至擴增到能夠進行檢測的量。而新型檢測系統的關鍵在於化學合成的短鏈DNA「primer」。
  • 科學家研究出新冠病毒檢測方法,感染後24小時就能辨識
    科學家研究出新的檢測新冠病毒的方式。圖為紐約市衛生部門實驗室進行新冠病毒檢驗。路透英國衛報報導,美國軍方僱用的科學家研發出新的新冠病毒檢驗方法,這項方法可讓帶原者在具有感染力、傳播疾病之前就被辨識出來。這可能是一項重大突破,計畫協調人希望這種血液檢測方式可在病患感染病毒後24小時內(在出現症狀或被視為有傳播病毒能力數天之前),就偵測到病毒的存在。目前的方法要在感染約四天後才能檢測出病毒。
  • 新冠病毒檢測須知|新型冠狀病毒|新冠病毒|威海市立醫院|呼吸道...
    (申請人可通過威海市立醫院官方微信號查詢檢測結果,也可次日8:30後自行到核酸篩查門診取報告單)4、收費標準:「新型冠狀病毒核酸檢測(含檢測試劑)」每次150元; 「嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒抗體測定(含檢測試劑)」IgG和IgM每項50元。其他費用按物價有關規定執行。
  • 新冠病毒核酸 10合1 混採檢測技術規範解讀
    該方法適用於低風險人群新冠病毒核酸的普遍篩查,不適用於 「中、高風險及重點人群」 新冠病毒的檢測。該規範的制定有效滿足了我國目前新型冠狀病毒疫情常態化防控需求,大幅提升了對低風險人群 [1] 新冠病毒核酸檢測的能力和效率,對指導各地做好新冠病毒核酸混採檢測工作和應對秋冬季新冠肺炎疫情有重大意義。
  • 北京大學教授黃巖誼:新冠病毒實驗室如何進行檢測研究?
    黃教授介紹了檢測新冠病毒的技術方法、原理、結果判斷及實際應用上的局限性。他表示:新冠病毒的檢測主要分為核酸檢測和抗體檢測,這兩個檢測方法完全不一樣,目的不同,採樣不同,方法不同,結果解讀不一樣,適用範圍也不同。分子診斷對於疾病診斷來說是重要的組成部分。疾病的診斷是一個複雜問題,尤其是對新發傳染病來說,在已知病原體的情況下分子診斷成為極為重要的指標。
  • 變異新冠病毒或已在美傳播 變異新冠病毒是原始病毒的「升級版」嗎?
    病毒在細胞內繁殖時,要為每個「子」病毒複製一份遺傳物質,而這些副本並不總是完美的,常會出現一些「錯誤」,即發生基因突變。有些「錯誤」造成的改變可能不利於病毒生存,有些則可能使病毒變得更易傳播,甚至致病性更強。新冠病毒屬於RNA(核糖核酸)病毒,變異相對較快。