動態光散射技術入門及儀器採購指南

　　作者：馬爾文儀器公司納米顆粒及分子鑑定產品營銷經理 Stephen Ball

　　動態光散射(DLS)是一項用於蛋白質、膠體和分散體的極具價值的粒度測量技術，其應用範圍可輕鬆擴展到1 nm以下。本文中，馬爾文儀器公司產品營銷經理Stephen Ball將向您介紹DLS的工作原理，並就購買光散射系統時的關注事項為您並提供一些專業建議。

　　通過觀察散射光，可以測定粒子分散體系或分子溶液的特性，如粒度、分子量和zeta電位。光散射系統充分挖掘利用這些特性之間關聯，並在近幾十年間經過不斷完善，目前已經能為常規實驗室應用提供高度自動化的檢測。利用光散射儀器的檢測快速而高效，可用來表徵分散體系、膠體和蛋白質。

　　理論上，光散射儀器中使用的各種技術看起來可能很相似，但它們的功能和檢測結果卻在實際應用中千差萬別，從而對儀器的壽命期價值產生顯著影響。光散射系統中的組件和設計的差異也會導致數據質量及儀器適用範圍產生很大的差異。例如，某些光散射系統可通過測量蛋白質電泳遷移率對蛋白質電荷以及粒度進行測定，從而成為生物製藥應用中高效的選擇方案。

　　撰寫本文的目的在於為考慮採用動態光散射DLS技術的讀者提供一個入門指南。本文將考察DLS的主要用途、應用領域，尤其會側重系統設計中對於特定性能的重要性，從而為那些正為自身需求而關注DLS技術的用戶提供背景信息和理論支持。

　　了解基本知識

　　當我們要開始對一種新的分析技術進行評估時，第一個重要步驟就是要了解它的基本工作原理。DLS的優勢之一是它操作非常簡單，而這直接源於它的測量原理。

　　由於熱能，溶劑分子不斷運動，和懸浮的顆粒物產生碰撞，使得分散體或溶液中的小顆粒做無規則的布朗運動。可以通過觀測散射光隨時間的波動性得到顆粒布朗運動的速度，這種技術被稱為光子相關光譜法(PCS)或準彈性光散射法(QELS)，但現在通常稱作動態光散射法(DLS)。

　　斯託克斯 - 愛因斯坦方程定義了顆粒布朗運動速度與顆粒大小之間的關係：

　　

　　其中，D = 擴散速度， k = 波爾茲曼常數，T = 絕對溫度，h = 粘度，DH = 流體力學直徑

　　上述關係式清楚地表示了在樣品溫度和連續相粘度已知的情況下，如何根據擴散速度測定粒徑。儘管必須是控制檢測溫度，但很多商用儀器還是會對溫度進行測量;而對於許多分散劑，尤其是水而言，粘度是已知的。在很多情況下，DLS實驗所需的補充信息也僅僅是粘度測量。

　　DLS的優勢

　　DLS固有的操作簡便性意味著操作者無需具備很強的專業知識就能得到詳盡而有用的數據，這個優點在最新的高度自動化系統中表現得尤為明顯——一般分析只需要幾秒鐘的時間，並且分散劑的選擇餘地比較大，不管是水性還是非水性的，只要它們呈透明狀並且不太粘稠，就都可以使用。這種測試方法所需的樣品量也很小，最少時只需要幾微升即可，這一點對於涉及寶貴的樣品的早期研究而言是極具吸引力的。

　　實際上，DLS法在測量0.1 nm ~ 10 µm範圍的粒徑時十分出色。它在測量小顆粒方面的能力尤為突出，對於絕大多數待測體系提供2nm及以上的準確、可重複的數據。從理論上講，檢測低密度分子的粒徑僅僅受到儀器靈敏度的限制，但對緻密顆粒而言，沉降是可能導致分析不準確的一個潛在問題。例如，對於密度為10g/ml的顆粒，最大檢測粒徑通常會限制在大約100nm以內。

　　無論是稀釋樣品還是混濁樣品都可以用DLS法來進行測量，可分析的濃度範圍最低可至0.1ppm，最高可達40%w/v。不過，由於樣品濃度會大大影響其外觀尺寸，因此當粒子含量較高時對樣品的製備需要加倍小心。

　　上述適用的粒徑和濃度範圍以及該測量技術的高重現性(粒徑20nm時可達到+/- 0.1nm)，使得DLS這種測量方法具有廣泛的適用性。比如，它特別適合檢測平均粒徑的細微變化，這種變化可能會反映出膠體樣品的穩定性;它也可以測得少量聚集體的出現。上述這些現象很有可能是某種樣本解體的前兆，當用於藥物的蛋白質研究時，這類情況的出現有可能對藥物性能產生不利甚至有害的影響。

　　DLS法的局限性

　　DLS方法的大多數局限性可以或已經通過對實驗操作過程進行改進，或對DLS技術進行改進來加以克服;但在區分儀器類型，尤其是對於那些要求異常苛刻的應用而言，它的局限性仍然值得我們加以關注。一般來說，DLS使用過程中遇到的大多數問題是出於以下原因：

　　♦ 存在較大的顆粒

　　超出儀器最高量程範圍的顆粒應該事先被過濾掉。或者，如果大顆粒的存在量極少也可以通過軟體進行處理。

　　♦ 沉澱

　　這種現象在較為緻密的顆粒中尤其比較容易出現。提高分散液密度是比較有效的抑制方法(比如在系統中加入蔗糖)，但這種方法僅適用於密度不高於1.05 g/ml的樣品體系。

　　♦ 解析度較低

　　DLS不屬於高解析度的技術。當樣品的粒度分布排列十分密集，且存在三種以上的粒度分布差異時，DLS 將無法對多重分散樣品進行精確表徵。在這種情況下，建議最好在測量之前對樣品進行分離;而在測量方法上，則需要將DLS與製備技術如凝膠滲透法或尺寸排除色譜法(GPC / SEC)和(或)流場分離技術(FFF)聯合使用。

　　♦ 多重光散射

　　多重散射是指從一個顆粒發出的散射光在到達探測器之前又會被其它粒子再次散射，在較緻密的樣品中，這種現象會使粒徑計算的精確度受到影響。背散射檢測器以大於90°的角度進行測量，大大抑制了這一現象，從而擴大了該技術的測量範圍。

　　♦ 分散劑的選擇

　　雖然大多數分散劑都適用於DLS，但如果分散劑粘度大於100mPa.s，往往會影響測量的可靠性，另外分散劑對光的吸收也會對檢測產生幹擾。比如有色樣品的散射光強度可能會有所降低。一種可行的解決方案是根據系統的靈敏度，採用不同的雷射波長進行分析或對樣品進行稀釋。樣品中的螢光也會對信噪比造成影響，但可以通過使用窄帶濾波器來解決，以排除螢光雜散光的影響。

　　界定DLS檢測儀的特性

　　上述的討論是在對DLS儀器的界定特徵進行檢驗的背景下展開的。對於任何分析技術，靈敏度都是最基本的要素，對於DLS系統，這方面的性能是由光學硬體和相應的設置來確定的。稀釋度較高時，具有優越光學設置的系統能對較小的顆粒進行可靠測量，但對於在這些功能方面要求不高的應用而言，替代方案可能會更為經濟。光學設置的主要元件包括：

　　♦ 雷射源

　　具有低噪特性的穩定雷射源最為合適，如某些氦氖氣體雷射器。也可以使用某些特定的固態雷射器，但價格要貴得多;低成本的固態雷射器使測量結果的精度和可重現性受到極大影響。

　　♦ 光學設置

　　光學設置的核心是進行測量的散射角。測量角固定於90o 時，可使系統簡便而經濟高效，為許多應用(見圖1)提供合適的靈敏度級別。這類系統已得到廣泛使用。

　　當實驗需要靈敏度更高，或樣品濃度更高時，最好選擇較大的測量角度。例如馬爾文儀器公司Zetasizer Nano系列雷射粒度儀，採用非侵入式背散射檢測器 (NIBS)，將測量角度調到175o(參見圖1)，擴大了顆粒粒度與濃度的測量範圍。由於入射光無需通過整個樣品，因此顯著減少了多重散射引起的測量不準確性，同樣也排除了大灰塵顆粒的影響。

　　在上述兩種類型的設置中採用了光纖光學收集組件，其提供的信噪比優於傳統的相應部件，從而大大提高了數據質量。

　　♦ 檢測器

　　檢測器有兩種類型：一種是便宜、靈敏度較低的光電倍增管PMT，另一種是較昂貴的、性能更好的雪崩光電二極體檢測器(APD)。後者宣稱效率高達65%，遠遠優於替代產品PMT4-20%的效率，從而使數據收集最大化，測量速度更快、質量更高。

　　要獲得精確的DLS測量，另一項基本要求是必須對溫度進行很好的控制。如同分散劑粘度一樣，顆粒的布朗運動也直接和溫度相關，因此溫度控制較差造成的影響非常嚴重。例如，在環境溫度下對水性體系進行測量，1oC的溫度誤差將導致2.4%的檢測結果偏差，超過ISO13321 [1] 標準規定的+/-2% 或更新的 ISO 22412[2] 標準規定的範圍。對於使用的各類比色皿，DLS儀器溫度控制的合理目標是 +/-0.2oC。

　　比起在檢測儀外部連接水浴裝置，內置溫度控制器在使用上更加方便，在測量精度、穩定性和重現性方面也更加可取。此外，具有高性能控制系統的儀器，既能進行快速的系統預熱，又能迅速調整溫度，從而對溫度變化所產生的影響(如蛋白質熱不穩定性)進行研究。

 

　　日常使用

　　當選擇儀器時，評估整體性能特點尤為重要。然而，如果每天使用一個不太符合操作要求的系統所造成的不便會令人非常煩惱，甚至不想再去用它。因此，當需要在最終幾個備選儀器之間進行選擇時，以下幾個問題是值得考慮一番的：

　　♦ 我最重要的需求是什麼：速度還是準確性?

　　♦ 我的樣品粒徑的範圍?

　　♦ 我要測量的樣品屬於什麼類型，比如是否有毒?或者具有特別強的腐蝕性?

　　♦ 今後儀器的操作者是專家還是新手?他們具備多少關於光散射的專業知識?

　　速度與準確性

　　DLS測量通常成批進行，樣品通常不同、且體積較小。測量時間一般按照能達到要求的重複性水平設置，但一般不大會超過幾分鐘。不過，分析效率可能因樣品製備和系統清洗要求而有所不同，不同系統的使用方便性也會有較大的差異。如果DLS系統被用作 GPC/SEC 檢測器，系統將設置為流體工作模式。由於樣品流經儀器，為達到必要的精度，測量必須在短短幾秒鐘之內完成。

　　具有良好測試速度和準確性的儀器通常都價格較高，但考慮使用壽命期的成本更為重要。考慮到因不能滿足重複性標準而進行反覆實驗所花費的時間和成本，以及因儀器裝備不能滿足常規實驗室使用要求而造成的分析效率下降等因素，更昂貴一些的系統也許更能體現物有所值。

　　適用於各種樣品類型的比色皿

　　大多數光散射系統在批量樣品分析期間使用各種比色皿池或比色皿來盛放樣品。它們通常是塑料(通常是聚苯乙烯)、玻璃或石英材質的，但大小各不相同。樣品的最小用量取決於光學設置，通常為2-3 ml。不過，如果不考慮任何樣品回收要求，也有一些系統測量只需要2µl的樣品用量。

　　一次性塑料比色皿無需清洗，消除了交叉汙染的風險，特別適用於盛放有毒材料;有些比色皿只有50 μL大小。採用比色皿可以避免產生『非比色皿』系統(即把樣品直接放在玻璃片上進行測量)因清洗不徹底而導致測量不準確的問題。石英比色皿具有更佳的測量質量，尤其是用於低濃度或小粒徑樣品時，這是因為石英材料具有優異的光學特性和抗劃傷性。

　　減輕分析負擔

　　光散射通常只是許多研究人員在實驗室中常規使用的多種技術之一。儀器操作者可能不是光散射方面的專家，因而儀器操作的簡便性是很有幫助的。

　　一些DLS系統在數據收集過程中即對數據進行評估，剔除因大顆粒存在而被汙染的結果。這類些系統有助於提高樣品製備的速度和容許範圍。粒徑大於10微米的顆粒主要發生向前散射，因此含背散射檢測器的儀器對這些顆粒的存在不太敏感。測量濃度範圍寬的系統儘可能降低了樣品稀釋的需求，進一步提高了測量效率。

　　大多數現代化測量系統在數據採集過程中都無需操作員幹預，從而減少了分析師的工作量，並提高測量的可重複性。但是有些比較複雜的樣本可能需要採用特殊方法進行測量，因此應在標準操作程序(SOPs) 中包含這些特殊方法，從而確保應用的標準化。

　　雖然自動測量現在已很普遍，但在內置數據分析支持程度方面，不同儀器之間的差異很大。如果是給非專業人員使用的光散射測量系統，那麼含有內置數據分析和專家意見的先進軟體將極富價值，就好像在電話另一端有一位可靠的、活生生的專家一樣。

　　總結

　　DLS是一項比較成熟的技術，可為各種類型的樣品進行粒徑和分子尺寸測量。因此，在選擇儀器時，必須將系統能力與用戶要求緊密聯繫起來，使兩者相匹配。光散射系統在測量粒徑的同時，還可以測量分子量、蛋白質電荷和Zeta電位，甚至還能具有微流變學測量功能。

　　不同系統之間的靈敏度有很大差別，如同在高濃度下也能進行測量一樣，也可對各種大小的顆粒或分子進行有效的測量。與那些90o 度探測器相比，背散射儀器具有很實際的優勢。

　　除了性能以外，還有其它因素也會影響儀器使用壽命期內的價值，包括易於清潔;能獲得的支持以及友好的用戶軟體界面。無論是什麼規格的儀器，最好的建議是在購買前進行測試，看看你能否輕鬆得到有用的數據。DLS問世已經多年，因此不論你的用途是什麼，你都可以期望擁有一套有使用針對性的、富有成效並且易於操作的測量系統。

　　結束

　　參考文獻：

　　[1] ISO 13321 (1996) 粒度分析 - 光子相關光譜。

　　[2] ISO 22412 (2008) 粒度分析 - 動態光散射

　　[3] GPC / SEC靜態光散射技術說明，(馬爾文儀器公司白皮書)。下載網址：www.malvern.com/slsforgpc

　　[4] www.malvern.com/aurora

　　圖片

　　圖1：DLS系統的關鍵組件包括(1)雷射器，(2)測量單元，(3)檢測器，(4)衰減器，(5)相關器和(6)數據處理PC。探測器可置於90° 或更大的角度，例如這裡所顯示的NIBS檢測器設置在175°。

　　圖2：在懸浮液穩定性研究中採用Zeta電位對粒子之間斥力進行量化

　　laser:雷射器

　　attenuator:衰減器

　　detector:檢測器

　　digital signal processor 數位訊號處理器

　　correlator:相關器

　　Electrical double layer:雙電層

　　Stern layer：嚴密電位層

　　Diffuse layer：擴散層

　　Negatively charged particle：帶負電荷的顆粒

　　Slipping plane：滑動面

　　Surface potential：表面電位

　　Zeta potential：Zeta電位

　　Distance from particle surface：到顆粒表面的距離