實驗室SAXS儀器對HAS蛋白進行SEC-SAXS聯用

小角X-射線散射廣泛應用於結構生物學來確定蛋白質的尺寸和形狀。溶液中的生物大分子可以以多種構象存在，並且一般具有很強的團聚傾向，在沒有預先純化的情況下，對此類分子的數據解釋有時會很繁瑣。

分子排阻凝膠色譜 (SEC) 能夠根據分子的大小進行分離。SEC 與SAXS 聯用可以顯著提高數據質量，從而提高數據解釋的準確性。

簡介

小角X-射線散射 (SAXS) 是生物化學等大分子樣品研究中常用的方法。在過去的幾年裡，由於光束傳輸(第3代和第4代同步加速器、現代實驗室X-射線源)、探測技術和數據解析方面的進步，SAXS 測量取得了顯著的增長。

在現代同步加速器設備中，分子排阻凝膠色譜 (SEC) 是在SAXS線站上建立的一種製備方法。尺寸不同的分子混合物(如單體、二聚體等)經過SEC純化，可以得到單分散組分。其基本原理是不同尺寸的大分子在多孔色譜樹脂上的停留時間不同。因此，大分子比小分子的洗脫速度快，使得按大小將單個的餾分分開。SEC實驗通常是通過紫外吸收測量來確定哪個時間哪個組分被洗脫。

實驗室儀器的最新進展(如基於液態金屬靶材或高功率的封閉靶等高性能SAXS儀器)使得這種方法也可以適用於實驗室設備，為研究和常規測量提供了更多的可能性。

這裡我們所示的SEC-SAXS 聯合實驗是在安東帕的SAXSpace儀器上對HSA蛋白樣品進行的，以說明在實驗室儀器上進行測量的潛力。

實驗細節和討論

使用標準的FPLC系統和安東帕SAXSpace儀器搭建在線SEC–SAXS 。由於在線測量的性質，樣品的特定組分從SEC柱中洗脫時直接測量。

利用現代實驗室SAXS儀器的高通量，可以在短時間內獲得足夠好信噪比的蛋白質散射數據。

圖 1: SEC-SAXS 裝置所示 SAXSpace 儀器 (前)

和 GE ?kta Pure 25 (後)

通過將人血清白蛋白HSA溶解到緩衝溶液中，製備了人血清白蛋白樣品溶夜。所使用的緩衝溶液 (pH 7.5) 組分為20 mM 三(三(羥甲基)氨基甲烷)、150 mMol NaCl和3 % 的甘油。最終HSA濃度為20 mg/mL。

樣品在注射到SEC柱之前沒有經過進一步的純化。使用GE ?kta Pure 25 FPLC儀器進行了分子排阻色譜分析。表1總結了SEC實驗詳細設置參數。

表 1: SEC 測量的實驗設置

SAXSpace 儀器的FlowCell中的管子可直接連接到?kta Pure 25 SEC 儀器UV 傳感器的出口，以儘量減小管子長度。

樣品已注射到SEC柱上，沒有進一步淨化。對於SEC運行，得到圖2所示的色譜圖。單體的信號(尖銳強峰)和低聚物的信號(主信號前的小峰)可以清楚地識別出來。

圖 2: HAS蛋白樣品的SEC色譜圖。 單體峰位由灰色虛線表示。單體洗脫前的峰對應不同的低聚物

SAXS測試是使用安東帕SAXSpace儀器進行的。表2總結使用的實驗參數。

表 2: HAS蛋白SEC-SAXS測試的實驗設置

對單體蛋白質分子的原始散射數據進行進一步的分析。確定了單體洗脫峰的散射曲線，並取其平均值。總共得到了這個區域內具有恆定散射曲線的10幀數據。然後使用 SAXSanalysis 軟體對這10幀數據進行平均並進行背景扣除(圖 3a)

即使在總共只有100 s的極短曝光時間內，也能獲得極好的數據質量。這允許使用SAXSanalysis 對散射曲線進行Guinier外推來計算迴轉半徑(Rg)。

Rg值為2.8 nm，這與文獻值吻合較好。

為了獲得實空間結構的信息，利用GIFT軟體對散射曲線進行了傅立葉變換。圖 3b所示的是對距離分布函數(pddf)結果，顯示的是dmax約為10.4 nm的典型單分散蛋白結構的pddf。

圖3：(a)實驗測試散射曲線與GIFT軟體擬合曲線吻合

(b)GIFT軟體的IFT計算的對距離分布函數PDDF曲線

結論

在實驗室儀器如安東帕SAXSpace和SAXSpoint等儀器上使用在線SEC-SAXS大大提高了在自己實驗室進行蛋白質分析的可能性。

即使是具有很強團聚傾向的蛋白質也很容易被測定，因為分離和測定之間沒有延遲。由於測量可以在停止流動模式下，因此也可以測量高度稀釋低聚物和弱散射小分子。

這進一步減少了同步加速器測量的需求，減少了旅行時間和敏感樣品的運輸。