新型CD19 CAR-T 治療B細胞淋巴瘤

CD19-PD-1/CD28-CAR-T對PD-L1過表達B細胞淋巴瘤的作用

Clin Cancer Res （IF:10.017）在線發表

第一作者：劉輝

共同第一作者：雷文，張超亭（北京大學腫瘤醫院）

通訊作者：錢文斌，陸哲明（北京大學腫瘤醫院），Ken H. Young（杜克大學）

嵌合抗原受體 T 細胞（CAR-T）是一類經基因工程技術改造後的T細胞，能直接識別腫瘤細胞表面的抗原從而特異性殺傷腫瘤細胞。CAR是由細胞外結合結構域、跨膜區和細胞內信號/激活結構域組成的合成分⼦，細胞外成分由衍生自抗體單鏈可變區片段（scFv）的輕鏈和重鏈區組成，以獨立於MHC的方式識別並結合特異性腫瘤相關抗原（TAA）。鉸鏈區通常衍⽣自CD8或IgG4分子，其用以連接細胞內和細胞外成分。最後一部分由觸發T細胞激活的CD3ζ片段組成。第⼀代CAR載體僅有CD3ζ結構域，第二、三代除CD3ζ結構域外，各增加1-2個共刺激結構域（CD28和/或4-1BB），所有這些成分通常使用γ-逆轉錄病毒或慢病毒轉導系統插入。

CAR-T治療在惡性血液腫瘤方面，如急性B淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤均取得了較好的臨床結果。但CAR-T治療仍然面臨很多問題和挑戰：首先，不是所有的患者都對CAR-T治療敏感，存在治癒率低的問題；其次，接受CAR-T治療後即使獲得完全緩解的患者仍會出現疾病復發。另一方面，CAR-T治療面臨的毒副反應，如出現嚴重的細胞因子釋放症候群（CRS）以及腫瘤微環境的免疫抑制作⽤等問題亟待解決。

2010年，Kochenderfer等首次報導了CD19-CAR-T細胞治療一例B-NHL的療效，該研究所用的CAR-T細胞包含了一個CD28共刺激分子。目前的CD19-CAR-T可使超過40%的患者得到持續的緩解。但是如何進一步提高CAR-T細胞的療效，減少疾病復發是該領域研究的熱點。有研究發現小分子靶向藥物能增強CAR-T細胞的療效。聯合使用CAR-T和免疫檢查點抑制劑，已被證實可增強CAR-T細胞臨床反應和擴增。另一個阻斷這條通路的策略是通過一個「裝甲」CAR-T細胞傳遞PD1抑制劑，該細胞會隱藏一個免疫檢查點，從而阻斷單鏈可變片段（scFv）。這一策略在PD-L1+血液腫瘤和實體腫瘤的同基因和異基因小鼠模型中效果顯著。另外，一種新型的PD-1/CD28嵌合體包含PD-1胞外結構域的開關受體融合到共刺激分子CD28的跨膜和胞質結構域，不僅與其配體PD-L1結合，而且傳輸激活信號（通過CD28胞質結構域），而不是通常由PD-1胞質結構域轉導的抑制信號。因此，T細胞通過兩種方式進行轉化。與抗CD19-CAR-T細胞相比，抗CD19-CAR和PD-1/CD28嵌合開關受體可能具有更有效的抗腫瘤作用，特別是對於PD-L1+B細胞淋巴瘤。

我們構建了一種表達PD-1/CD28嵌合開關受體的新型CD19特異性CAR-T，稱為CD19-PD-1/CD28-CAR-T。並從下面幾個方面對其機制進行了探索：1）CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞增殖和細胞亞群類型；2）CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞因子釋放；3）CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞對PD-L1+Raji細胞殺傷能力；4）CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞對荷瘤小鼠的抗腫瘤活性。

T細胞主要分CD4+與CD8+兩個亞群。根據T細胞功能和表型則可分為初始T細胞（Tnaive）、記憶T細胞（TM）和效應T細胞（TEF/TEMRA）。TM又分為效應記憶T細胞（TEM）和中央記憶T細胞（TCM）。TCM或Tnaive來源的CAR-T細胞具有更強的抗腫瘤能力，且作用持續時間更長。與傳統的CD19-CAR-T細胞相比，CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞中的TCM、Tnaive比例升高。有研究表明，參與產生T細胞記憶的共刺激受體，如NKG2D和CD27的上調，可能有助於增強CAR-T細胞的細胞溶解能力。在與絲裂黴素C處理的PD-L1+ Raji細胞競爭作用時，參與T細胞記憶生成的共刺激受體—NKG2D和CD27的水平，在CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞中明顯上調。

圖：表達PD-1/CD28開關受體CD19-CAR-T細胞增強了PD-L1陽性淋巴瘤細胞的抗腫瘤功能

細胞因子是調控免疫系統的重要組成部分，可通過自分泌或者旁分泌方式介導各類免疫細胞之間的溝通，起到信息傳遞的作用。細胞因子與CAR-T細胞的功能和臨床治療效果關係密切。CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞分泌大量重要的免疫刺激細胞因子：IL-2、IFNγ和TNFα，尤其在E/T比率高的組別裡更顯著。尤其是IL-2的分泌，在不同E/T中CD19-PD-1/CD28-CAR-T組均明顯增高。INF-γ是Th1的自分泌生長因子，是抗腫瘤的主要細胞因子。IL-2是一種T細胞生長因子，激活狀態下的CD4+T細胞以及CD8+T細胞都能分泌。IL-2 在終止T細胞功能維持自身耐受方面發揮重要作用，通過與IL-2R結合阻止T細胞過度激活。CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞分泌大量IL-2、IFNγ和TNFα細胞因子，提示其良好的抗腫瘤作用，又可避免T細胞過度激活導致的細胞凋亡。為新型CAR-T細胞的臨床治療提供依據。

圖：血清生物標誌物動力學

本研究是第一個用表達PD-1/CD28嵌合開關受體的CD19-CAR-T細胞治療R/R大B細胞淋巴瘤的多中心研究。數據顯示出良好的安全性和持久的臨床反應。所有17例入組患者在接受這項試驗之前都接受了強烈的化學免疫治療和新藥物，如西達本胺和來那度胺的治療，因此對治療有挑戰性。而且有高比例患者腫瘤細胞是PD-L1陽性，提示疾病的複雜和難治性。

表：17例患者基線水平

PD-L1+的閾值設為5%，26%～75%的DLBCL腫瘤標本中有PD-L1的表達，而且淋巴瘤細胞PD-L1表達與總體生存率低相關。PD-L1與T細胞上的抑制性受體PD-1結合，導致T細胞耗竭。在大B細胞淋巴瘤中，PD-L1在腫瘤細胞中的表達被證明是對CD19-CAR-T細胞治療耐藥的潛在機制。PD-1/CD28開關受體是一種工程受體，它通過與PD-L1的結合來傳遞激活信號而不是抑制信號，這種開關受體已被證明能通過CAR-T細胞的浸潤，增強CAR-T細胞抗腫瘤活性，從而降低腫瘤對誘發功能低下的易感性，減弱抑制性受體的表達。

在這項Ib期臨床試驗中，17例患者中有10例（58.8%）在CAR-T治療後3個月內達到客觀療效，其中7例（41.2%）達到CR，13例DLBCL患者7例有效，有效率為53.8%，其療效與t-cel相似，甚至優於t-cel的結果，提示CD19-PD-1/CD28-CAR-T有可能改善復發或難治性疾病的PD-L1+大B細胞淋巴瘤患者的預後。

在現有有關CAR-T的文獻中，CAR-T細胞在體內不斷擴增和持續存在的意義仍存有爭議。在一些報告中，它與B細胞惡性腫瘤的緩解有關，但在另一個報告中並沒有顯示出顯著的預後影響。我們不僅觀察到CAR-T細胞的更高的擴增，而且還觀察到與PR和PD患者相比，CR患者外周血中CAR-T細胞的持久存在。以往的研究發現，在小鼠模型中分化相對差的T細胞亞群（如T記憶幹細胞）具有比分化更好的T細胞亞群更高的增殖能力、更持續的存在性和更高的抗腫瘤活性。我們還觀察到CD19-PD-1/CD28-CAR-T獲得了更低分化的表型，而在Raji-PD-L1細胞體外實驗中，CD19-CAR-T表型為較一致的分化的T細胞，包括效應記憶T細胞和終末分化的效應T細胞。

患者對CD19-PD-1/CD28-CAR-T細胞的治療具有良好的耐受性，毒性較輕，尤其是CRS。一個可能的原因是CD19-PD-1/CD28-CAR-T比CD19-CAR-T在PD-L1+Raji細胞中產生更少的IL-6，這是一種在CRS病理生理學中起關鍵作用的炎性細胞因子。這一發現也與血清IL-6和IFN-γ水平較低的患者的臨床病程相一致。另一種可能的機制是PD-1/CD28嵌合開關受體在免疫抑制性腫瘤微環境中，可以提供一種潛在的方式來特異性激活CAR-T細胞。血清細胞因子水平較低的患者中，CD19-PD-1/CD28-CAR-T的細胞因子水平較CD19-CAR-T高，這些數據可能提示腫瘤微環境中T細胞存在持續的功能。本研究首次證實了CD19-PD-1/CD28-CAR-T在PD-L1+大B細胞淋巴瘤患者中的耐受性、安全性和令人鼓舞的療效，值得通過大規模、多中心臨床試驗進行進一步的證實和推廣。

參考文獻：CD19-Specific CAR-T Cells that Express a PD-1/CD28 Chimeric Switch-Receptor is Effective in Patients with PD-L1 Positive B-Cell Lymphoma.Clin Cancer Res.2020.Online ahead of print.