當細胞遇上拉曼 會碰撞出什麼樣的火花——訪牛津大學副教授黃巍博士

　　現在生物界有一個很重要的研究方向，同時也是目前國際上最前沿的研究領域之一：單細胞生物學，美國能源部、美國科學院以及歐洲科學院都很關注這個領域。據介紹，在過去的兩年中，每1到2個星期，重要學術刊物如Nature系列或Science都會有關單細胞技術的文章。而且，在劍橋的Sanger研究所單細胞研究中心就有這樣一句標語：「Single cell research is the new frontier of modern cell biology(單細胞研究是細胞生物學的新前沿)」，足見單細胞研究的重要性。

　　細胞是生物體基本的結構和功能單位，此項研究關係著胚胎的發育、癌細胞早期診斷、探索自然環境中佔絕大多數的不可培養微生物等各方面的問題。其實在很早就有科學家研究單細胞的檢測技術，包括顯微鏡、流式細胞儀、微流控及各種分離提取技術等，這些技術可以觀測到細胞的大小、形態等等，但是這些還不夠，其中最關鍵的問題是基於什麼信號來分離和研究細胞，這是科學界需要問的問題，也是儀器界需要關注的問題。

　　大約十多年前，拉曼走入了單細胞研究領域。為什麼會將拉曼用於單細胞的檢測?目前國內外的研究狀況如何?都取得了哪些成果?非常幸運的是，儀器信息網編輯在HORIBA主辦的第三屆國際拉曼前沿技術高端論壇（RamanFest 2015）上採訪到了將拉曼用於單細胞分析的早期開拓者之一，英國牛津大學的副教授黃巍博士。

英國牛津大學副教授 黃巍博士

　　單細胞如何遇到拉曼?

　　黃巍在國外生活了十七年了，主要研究環境微生物和合成生物學，過去十幾年中一直利用拉曼光譜進行單細胞的研究工作，同時也開發一些拉曼聯用技術，可謂是將拉曼引入單細胞分析中的「領路人」，是什麼樣的原因促使他將單細胞和拉曼聯繫在一起呢?

　　黃巍介紹到，「細胞那麼多，如何去大海裡撈針?有沒有一個方法能在這一群細胞裡找到有特殊功能或者特殊表型的細胞，將它們分選出來，然後再進行研究，這樣效率會更高一些，這也是為什麼將拉曼引入單細胞分析的一個重要的原因。」

　　「單細胞拉曼圖譜最大的特點就是無需外援標記，展現給大家的是細胞的內在信號，可以視為細胞的化學指紋或者化學畫像。」黃巍談到，所謂的化學畫像，是指細胞的表型(phenotype)，是基因和環境互相作用的結果。它不同於基因型(genotype)，基因型是由基因決定的，只是說具有某種潛質，但是不一定表達出來。也就是說，即使細胞的遺傳學完全一樣，表型也會出現變化，因為基因表達在某種程度上來說是一個隨機的過程。

　　「人和人之間可以通過表型例如長相、身材的不同來識別你我他，但是單個細胞在顯微鏡下很難從形態上看出有什麼不同，而我們可以利用拉曼技術得到單個細胞水平的分子畫像，進而進行細胞判別。單細胞拉曼圖譜可以看作一個細胞所有分子光譜指紋的總和，而細胞任何代謝的變化都會引起細胞表型的變化，因此從理論上講癌細胞的拉曼圖譜應與正常細胞的拉曼圖譜不一樣，在某種程度上來講，拉曼也許會檢測到這種變化，這在癌症研究，特別是乳腺癌的研究中已經做了很多的工作。我們是想發展這樣的一個概念，把單細胞的拉曼圖譜看成是單個細胞的表型。」黃巍介紹到。

　　「現在的很多研究都需要預知某個蛋白，然後設計一個抗體，用螢光標記，然後再進行研究。但是很多時候，要預知的本來就是需要解決的問題，比如細胞胚胎發育中哪些分子發生變化了，這個時候就可以用拉曼技術來觀察細胞的表型，拉曼起到探索的作用。」

　　「再者，微生物學領域一直有一個重大的挑戰，在環境中，包括人體腸道微生物裡90%以上的微生物還無法在實驗室分純培養，而這些微生物和人體的代謝以及一些疾病有很多關係，它們作為身體的一部分，影響著整個身體的代謝。由於不能培養，我們很難知道它們的生理功能，當時研究的驅動力就是想怎樣避開培養的問題去研究這些細胞的代謝，最終我們選擇了拉曼技術，而且我們知道採用穩定同位素技術可以把細胞和代謝直接聯繫起來，這也更堅定了我們在這方面研究的決心。」

　　「還有一點，現在的很多單細胞研究技術對細胞功能是有幹擾的，如果標記上抗體之後，細胞的行為就不是原來天然的行為了，而拉曼可以實現無標記的檢測。」

　　拉曼在單細胞檢測領域中的三大挑戰

　　黃巍在拉曼的單細胞分析領域已經耕耘了十多年，他說，現在高通量的分析方法，如DNA測序技術已經很成熟了，但是在表型方面的技術還比較欠缺，我們希望拉曼能作為檢測表型的技術，為單細胞的檢測技術貢獻一部分信息。此外，他們還希望將拉曼信號作為大數據的一部分，融入到整個單細胞大數據體系中去，據悉，這部分工作在牛津大學才剛剛開始。

　　不過，同時，黃巍也介紹了拉曼在單細胞檢測方面面臨的三大挑戰：

　　首先，拉曼信號的增強。拉曼信號天然很弱，如果採用SERS增強技術就要用金、銀等納米材料等進行修飾，這還在研究和探索過程中，而且現在對SERS的機理研究還不是很透徹，怎樣提高檢測靈敏度和解析度，這是最重要的挑戰;

　　第二，拉曼單細胞技術和其他技術的整合。在單細胞分析中，利用拉曼技術將細胞分選出來之後要進行單細胞測序或微流控在線培養，如何將分選技術與下遊的測序技術、培養技術結合起來是一個挑戰;

　　第三，單細胞拉曼信號的解析。單細胞拉曼信號是多分子疊加在一起的結果，甚至還有一些未知的特殊分子、蛋白等，沒有標準，怎樣分析、理解這些拉曼信號，如何進行數據的提取和處理也是一個很大的挑戰。

　　FACS與RACS：互補，非替代

　　我們了解到，黃巍和中科院青島能源所徐健教授的團隊合作開發的「活體單細胞拉曼分選儀」(RACS)在2013年就通過了驗收並且有了樣機。對於目前的進展情況，黃巍介紹到，之前的樣機還處在研究應用階段，還沒有商業化出售，但是作為一個平臺已經做了很多樣品了。

　　雖然，世界上第一臺活體單細胞拉曼分選儀已經問世，但是研究並沒有停止，據黃巍介紹，2013年的樣機是針對具有光合作用的細胞，有一定的局限性。最近採用了「pause release」和單細胞彈射技術，就可以針對幾乎所有的細胞。「具體來說，我們通過控制微流控的流速，停一下，再分選，這樣就可以克服拉曼信號天然比較弱的缺點，同時還可以實現自動分選。其中，單細胞拉曼檢測和雷射彈射分選技術可用於精確分選複雜樣品和組織細胞，今年剛剛解決這個問題，預計今年年底之前就可以完成原理的證明等問題，同時也會出一系列的文章。」

　　當筆者問起，目前在單細胞研究領域用的最多的要屬流式細胞儀(FACS)，RACS的出現將會給FACS帶來哪些挑戰?黃巍介紹到，兩者之間並非是要相互替代，而是互補的。

　　黃巍介紹到，50年代開發的流式細胞儀，直到現在依然在用。流式細胞儀是基於螢光信號的，而每一個螢光信號都需要一個濾光片，最好的也就是可以同時看幾十個信號，而拉曼圖譜包括1000多個信號，是一個很複雜的指紋信息，相比FACS，RACS的拓展面要大很多。

　　「不過，兩者並非是要誰替代誰，總體來說是互補的，」黃巍介紹到，「雖然表面上看起來FACS比RACS速度快，但是RACS得到是整個細胞表型的圖譜，相當於給細胞畫像，如果是這樣的話就不算慢了。」

　　「此外，2007年，我們和維也納大學的Michael Wagner教授也發展了Raman FISH(拉曼-螢光原位雜交)技術，可以把螢光和拉曼的技術結合起來。螢光標記某些特定的細胞，可快速識別，作為粗篩，縮小範圍之後再用拉曼獲取單細胞表型，進行細分。」

　　同時，黃巍也指出，「FACS發展了40多年後才成熟，RACS要做到成熟，還需要一點時間。」

　　拉曼在生命科學「初露頭角」 合作是關鍵

　　據黃巍介紹，目前拉曼在生命科學中的研究目前主要聚焦兩個方面的應用：微生物學和醫學方面。其中後者的驅動力更大一些，主要體現在兩個方面，一個是通過拉曼光譜技術進行癌症的早期診斷，第二個是更加前沿的拉曼輔助手術(Raman aided surgery)技術，即利用拉曼光譜技術幫助醫生快速判斷潛在的癌細胞，指導醫生的手術，德國在這方面的研究比較多，雖然現在還只是處在實驗階段，但在臨床上已經勾畫了美好的藍圖。

　　但是，作為一項非常前沿的技術，現在拉曼在生命科學中的應用研究才剛剛露出水面，還處在早期階段，不過，國外已經開始認識到它的重要性，很多課題組已經小有成果。

　　鑑於拉曼的優勢，現在學術界普遍看好拉曼在生命科學的應用，很多老師反映，在德國耶拿舉辦的第24屆國際拉曼光譜學大會 (24th ICORS)上，拉曼在生命科學中的研究就已成為一大熱點話題。現在，國內的一些課題組也在嘗試將拉曼用於生命科學體系的研究中，但是目前還處於初級階段，有很多問題亟待解決，比如很多做化學的人不了解代謝的機理，亦或做生物的人很難解析拉曼譜圖等。

　　對此，黃巍談到，我個人認為這是一個分兩步走的過程，可以先從一個很簡單，很清楚的拉曼信號開始，比如我們採用了一個簡單的方法，利用重水中的氘穩定同位素探針來判別單細胞總體代謝活性，這個原理很清楚(最新研究成果：Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 13;112(2):E194-203.)。

　　此外，對於拉曼譜圖解析的問題需要很多人共同來解決，現在很多生物界的人沒有拉曼的基礎，但是化學家很清楚，也許當一個生物學家碰上一個化學家問題就會迎刃而解了。

　　因此，多學科的交流、合作是非常重要的，化學、分子生物學、遺傳學等各學科在一起交流才會有新的突破。

採訪編輯：葉建