新冠病毒核酸檢測假陰性/假陽性問題探索及解決方案

在此次新型冠狀病毒疫情中，作為最終確診的關鍵性技術，核酸檢測發揮了及其重要的作用。但是近期關於核酸檢測準確性問題的討論甚囂塵上，如何提高檢測的準確性，如何減少假陰性/假陽性成為困擾檢測工作者的重要難題。

從目前已有的資料來看，很多方面得到了討論，如：冠狀病毒感染人體後，病變主要發生肺部，即下呼吸道，上呼吸道咽部病毒含量低，通過咽拭子檢測常常出現陰性，再加上其他一些因素，比如：採樣不規範，運輸和存儲等造成病毒RNA降解，核酸檢測試劑盒的快速審批入市，質量參差不齊等等，這些環節都可能導致假陰性的發生。同時各環節操作的不規範，還容易出現假陽性的發生。

而從核酸提取質量，螢光定量PCR各品牌，各型號的對核酸檢測試劑的適應性的討論就不多見了，本文就病毒核酸提取、qPCR檢測、體系加樣等環節，在耶拿公司產品的基礎上提出了一系列解決方案， 供大家參考。

一、核酸提取：

作為核酸檢測的起始步驟，病毒核酸能否被高效安全的從樣本中提取出來，將會成為整個核酸檢測至關重要的一步。在多數核酸提取的過程中，操作者將面臨如下幾類問題：

1、咽拭子、血清、血漿等上樣量不足，現在普遍是200μL的上樣體積，病毒獲得不足，產生假陰性結果；

2、病毒富集效率低、裂解不充分，導致核酸產物收率較低而引起的假陰性結果；

3、提取產物富含高濃度鹽分、有機物等PCR抑制劑殘留，對後續定量PCR檢測產生抑制產生假陰性結果；

4、提取過程中過度的剪切力將本來含量不高的病毒核酸破環，病毒核酸完整度差，無法作為後續螢光定量PCR模板而導致的假陰性結果；

5、手工提取過程複雜，步驟繁多增加交叉汙染概率而導致的假陽性結果；

6、常規磁棒法全自動核酸提取儀因磁棒磁力下降導致磁珠殘留，進而導致交叉汙染出現假陽性/假陰性結果。

解決方案

德國耶拿公司InnuPure C16 touch全自動核酸提取儀，Cybio-Felix全能型工作站將人們從繁瑣的核酸提取純化過程中解放出來，大大提高了工作效率和產物質量。您只需要加入樣本，選擇相應的提取程序，按下「開始」即可輕鬆獲得純淨的核酸。

l 耶拿公司的C16 Touch核酸提取儀，最大上樣體積可到600μL，加大上樣量可以獲得更多核酸，降低假陰性的產生

l 產物無磁珠殘留，有效防止交叉汙染，降低假陽性；提取結果重複性、均一性更好

其配套的針對病毒提取的相關試劑擁有如下兩項專利：

◆ Dual Chemistry Technology

2005年耶拿公司發明了專利性的核酸提取技術DC-Technology（雙緩衝液技術），採用獨特的裂解緩衝液和新型的結合緩衝液，無需使用高鹽結合，提高核酸提取得率，以及更為完整的核酸片段，降低假陰性可能。

◆ Smart Extraction技術—新一代核酸提取技術

   2016年耶拿公司又發明了專利性的新一代提取技術Smart Extraction，該技術打破常規核酸提取需要藉助介質吸附核酸的傳統，提取過程無需酚/氯仿、無需離子交換、無需離心柱、無需矽膠膜、無需磁珠，僅需tip上下吹打即可完成。提取得到的核酸得率高、完整度高，純度好，降低假陰性的可能性。

二、螢光定量PCR檢測：

當檢測工作者收穫了高質量、低雜質的樣本核酸後，螢光定量PCR過程中的檢測靈敏度、特異性、重複可靠性就成為了獲取高質量檢測結果最至關重要的因素了。

1、基於儀器老化、設計缺陷等原因導致的螢光定量PCR儀溫度控制的準確性、均一性不高，結果擴增效率較低或者批次內和批次間的重複性不佳，導致假陰性結果；

2、不同型號儀器採用不同的激發光源對結果會有一定影響，某些光源使用一定時間沒有更換，對付近期的高強度檢測工作會進一步降低儀器的靈敏度，導致假陰性結果；

3、各類螢光定量PCR所採用的檢測器靈敏度是存在差異的，導致假陰性結果。

基於以上問題

德國耶拿公司qTOWER3系列螢光定量PCR儀，以其卓越的溫控系統帶來快速穩定的實驗結果，先進的光學檢測系統帶來高靈敏度的檢測。

l 鍍金純銀樣品槽，採用熱傳遞性非常好的銀質材料，快速的升降溫速率能夠加快實驗速度，縮短實驗時間，提高實驗效率。準確的溫度控制帶來優異的溫度均一性，進而帶來各樣品間以及各批次間穩定的定量PCR擴增結果。

l 採用藍色、綠色、紅色、白色四個高強度長壽命LED固態光源，確保在整個光譜檢測範圍內都有很強的激發光強，有利於較弱信號的採集，從而提高實驗檢測靈敏度，減少假陰性可能。LED光源壽命長，免維護，節約後續的使用成本。

l 採用定量PCR儀上最新一代的通道式光電倍增管（CPM）檢測器，有效降低背景噪音信號，檢測靈敏度比CCD或PMT（普通光電倍增管）高，提高檢測靈敏度，減少假陰性可能。

三、液體處理過程：

近期，各類關於檢測工作繁重，人員壓力大，復檢次數眾多等，相繼被各類媒體爭相報導。由此可見，面對如此重大的疫情，檢測人員所面對的工作壓力是非常巨大的。

1、在複雜的檢測工作中試劑、樣本的錯加、漏加都成為假陰性、假陽性產生的主要來源之一；

2、液體處理中的交叉汙染也成為了檢測假陽性結果的主要原因。

在如今的新時代，各類全自動液體處理工作站已經在全球各個生命科學、疾病藥物診斷研發、政府機構的高通量檢測領域中得到廣泛的使用。德國耶拿公司建議除了前面提到的核酸提取步驟可以採用全自動液體處理工作站高效的完成之外，PCR的體系構建等工作也可以採用類似的方法來解決。

德國耶拿公司Cybio-Felix全能型液體處理工作站，可自動完成定量PCR反應中涉及到的各類預混液、引物、模板、去離子水 等的加樣，代替手工快速、準確、高效地進行定量PCR反應體系的構建，適用於各類PCR體系及成品試劑盒的液體處理。

1、超高的移液準確性：確保在小體積量程下實現準確地加入模板內並且準確地分裝反應體系，有效的減少因加樣產生的假陰性結果；

2、PCR體系構建快速高效，提高檢測效率，讓更多的疑似患者能夠儘快明確：可在半小時內實現整版PCR體系構建；若採用整板的預混Mix，則完成速度更快；

3、有效避免交叉汙染：儀器運行時完全封閉，避免環境汙染；採用帶濾芯的tip，避免移液頭汙染；UV燈滅菌，避免批間汙染。且PCR體系構建速度較快能減少模板中DNA的揮發，減少系統內核酸氣溶膠的濃度大幅減少假陽性的發生概率；

4、提供可放置入於生物安全櫃中的型號，避免各類汙染，保護實驗人員安全。

核酸檢測結果是否可信，並不能一概而論，如果檢測儀器、試劑盒都沒有問題，且每個實驗環節都控制的很好，那麼結果就非常可信，反之則無法判斷。

讓我們齊心協力，用我們自己的專業知識來共同對抗疫情。