PCR技術的精髓，看這裡

2020-10-06 小析姐

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術，在1985年由美國Cetus公司的Kary Mullis首創，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。

優點：敏感度高、特異性強、產率高、重複性好以及快速簡便等，廣泛應用於微生物學、考古學、 法醫學及體育等領域，並已普及到許多普通實驗室, 大大簡化了傳統的分子克隆技術，從而比較容易地 對目的基因進行分析、鑑定。

PCR的原理

用於擴增位於兩段已知序列之間的DNA片段，類似於天然DNA的複製過程。以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端互補的寡核苷酸片段為引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留複製的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重複這一過 程，即可使目的DNA片段得到擴增。

PCR基本反應步驟

擴增的特異性取決於引物與模板DNA的特易結合，基本反應步驟分三步：

1、變性(Denaturation)：

加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。

94°C 30〃

2、退火(復性)(Annealling)：

突然降溫後模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合，也存在兩條模板鏈之間的結合，但由於引物的高濃度，結構簡單的特點，主要的結合發生在模板與引物之間。

55°C 30〃

3.延伸(Extension):

將反應溫度調節到酶的最適溫度，在DNA聚合 酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下，以引物的3'端開始，結合單核昔酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。

72°C 1〃

上述3步為一個循環，每經過一個循環，樣本 中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25〜40個循環後DNA可擴增106 〜109 倍。

PCR擴增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。

反應初期，原來的DNA擔負起使模板的作用，隨著循環次數的遞增，由引物介導延伸的 片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴增產物是介於兩種引物5'端之間的DNA片段。

PCR的成分和作用

1、緩衝液：

10~50 mM Tris- Cl (pH8.4)

維持Taq酶作用環境的偏鹼性

25~50 mM KCl

促進引物退火，＞50 mM會抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

對酶有一定的保護性，如質量不好將起相反的作用，建議使用乙醯化的BSA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。

2、MgCl2:

L5~2e0 mM

Taq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應 的特異性和擴增片段的產量，過量能增加非特異擴增並影響產率，過低則酶活性顯著下降。

3、dNTPs :

dATP、dGTP、dCTP、dTTP—底物

0.02 〜0.2 mM

dNTPs可與Mg2+結合，應注意Mg2+濃 度與dNTPs濃度之間的關係，Mg2+濃度比 dNTPs 濃度高 0.2~2.5 mM。

過高：加快反應速度，還可增加鹼基的錯誤摻入率和室驗成本。

過低：反應速度下降，可提高實驗的精確性。

4、引物(Primer-P):

預擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。0.2~1 μM

偏高：非特異產物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產量降低。

偏低：產量降低。


5、Taq DNA聚合酶：

耐高熱

0.5~5 U/100μL

1U/25~50μL

偏高：引物非特異產物的擴增。

偏低：產物量降低。

6、模板DNA (Template)：

最低102~105 bpDNA片段，實際用量遠遠 超過此量，用量需在實驗中摸索。1~5μL。

過高：非特異產物增加

過低：產量降低

7、水：

去離子水，補足整個反應體積。

PCR反應條件優化

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關鍵。

加熱90~95°C, 30~60s，再複雜的DNA 分子也可變性為單鏈。根據模板DNA複雜程度，可以調整變性溫度和時間。一般情況下選擇90°C 30〃,可使各種複雜的DNA分子完全變性。

溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。


2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決於復性過程中引物與模板的結合。

復性溫度的選擇，可根據引物的長度和G+C含 量確定，長度在15~25 bp之間時，復性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般位於40~600°C，30~60s。

復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。

一般情況下選擇55°C 30〃足以使引物與模板 之間完全結合。


3、延伸溫度和時間:

一般位於Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小於16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利於引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。

延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，<1Kb, 1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達15分鐘。

延伸時間過長可出現非特異擴增，常用72°C 1〃。


4、循環數:

其他參數選定後，PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。

理論上說20〜25次循環後，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由於每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。


（內容來源：百度文庫 由小析姐整理編輯）

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