關注我們，更多乾貨和驚喜好禮
陳兵
本期小編將分享下Orbitrap Exploris 240在生物藥表徵中的應用，愛爾蘭國家生物工藝研究培訓所用 Exploris 240對單抗樣品進行了肽圖和二硫鍵的分析；非變性分子量和電荷變異體的分析；以及多維度氧化翻譯後修飾的深度表徵分析，具體的應用實例如下
應用實例1: IgG2單抗的肽圖和二硫鍵分析
在肽圖分析中一級胺基酸序列分析可確定抗體序列的正確性，產品相關關鍵質量屬性的低豐度翻譯後修飾的鑑定和監測可以確保藥物的質量、療效和安全，二硫鍵能保持生物藥的穩定和確保其功能正常，所以肽圖和二硫鍵分析是生物藥表徵必不可少的項目。在Exploris 240質譜平臺對IgG2單抗Denosumab進行肽圖和二硫鍵的常規表徵分析，分析流程如下圖所示。
在肽圖分析中需要獲得高序列覆蓋率，CDRs區和關鍵區域需要被檢測到。得益於Exploris 240的高選擇性、高捕獲率和高靈敏度等特性，Denosumab僅用一種酶切的結果中，輕重鏈蛋白序列覆蓋率即均達到100%，表明蛋白序列正確。
高靈敏度使得低豐度翻譯後修飾能輕鬆被檢測到，下圖為低豐度的脫醯胺翻譯後修飾，一級質譜提供高質量精度的結果，質量偏差小於3 ppm，通過二級譜圖中特徵碎片b2和b3離子對脫醯胺修飾位點定位充分確定。
比較還原和非還原Denosumab樣品來確定其二硫鍵的連接方式，鏈內和鏈間二硫鍵均鑑定到，一級質量偏差均小於3 ppm。
小結：240質譜儀可以用於生物藥的常規表徵，僅用一種酶切即可實現抗體輕重鏈100%序列覆蓋，高靈敏度帶來高可信的低豐度翻譯後修飾的鑑定結果，高解析度帶來超高的質量精度鑑定結果，Biopharma Finder對複雜數據分析輕鬆得到可信的鏈內和鏈間二硫鍵鑑定結果。
應用實例2: 非變性條件下對IgG1單抗變異體的高靈敏度表徵
非變性條件下獲得的蛋白分子量質譜圖與變性條件下相比，其電荷價態之間能有更大的空間分離和更少的重疊狀態。通過液相分離酸性和鹼性蛋白異構體後質譜檢測蛋白質平均質量和保留時間對單抗電荷變異體（CVA）進行鑑定。
Orbitrap Exploris 240非變性質譜和CVA分析流程如下圖所示，其中非變性質譜使用尺寸排阻色譜(SEC)分離和CVA使用陽離子交換色譜(CEX)分離。
SEC-MS分析曲妥珠單抗稀釋液，上柱量0.05-50.0 μg，在m/z 5000到7000所有數據點都能清楚地檢測到，繪製相對於上樣量和多個電荷價態歸一化強度的標準曲線。檢測限LOD = 0.03μg，定量限LOQ = 0.08μg。從結果可知，Exploris 240分析低含量的蛋白質不影響譜圖質量，檢測低含量的糖基化修飾是可行的。
CEX-MS CVA分析需要非常高的質譜靈敏度，以確保對低豐度電荷變異體的可靠鑑定。2號單抗的CEX-MS分析顯示，與未修飾樣品相比，該突變樣品具有豐富的酸性異構體，對應的是脫醯胺類的洗脫早於未修飾的成分。在BPC圖中也觀察到其他形式的異構體（如：加K和片段化的形式），所有的異構體豐度都≤3%。
小結：240質譜儀非變性質譜操作簡單，獲得的數據譜圖信噪比高和質量精度高。在非變性質譜條件下進行完整的分子量分析，具有超高的靈敏度，可以對痕量樣品進行可靠的分析。離子交換色譜結合Exploris 240的可以在有限的樣本量研究中對單抗的異質性進行深入的表徵和可靠的鑑定。
應用實例3: 在完整蛋白、亞基和肽段水平對IgG1單抗氧化翻譯後修飾的多維度表徵
氧化是生物藥在生產和存貯中發生的最常見的翻譯後修飾之一，甲硫氨酸尤為敏感，氧化修飾作為關鍵質量屬性會影響到最終藥物的安全性和有效性，需要被檢測和監測。Exploris 240高分辨質譜可以鑑定到低豐度的氧化修飾和在肽段水平提供特徵的二級碎片離子進行位點鑑定，確保鑑定結果的可信可靠。
單抗Ipilimumab和golimumab分別從蛋白、亞基和肽段水平進行分析以評估氧化的情況，分析流程如下圖所示。
完整蛋白水平氧化翻譯後修飾的鑑定：如下圖所示，對比Ipilimumab對照品和強制氧化樣品，放大其中一個52+電荷價態質譜峰，糖型峰基線分離，信噪比高，最高3個糖型的質量偏差小於4 ppm，強制氧化的樣品與對照品相比有約64Da的質量差值，表明在完整蛋白水平可能有4個甲硫氨酸發生了氧化修飾。
亞基水平氧化翻譯後修飾的鑑定：Ipilimumab用Ides酶解和TCEP還原後得到Fc/2，LC和Fd』亞基，如下圖所示在mAbPac色譜柱上3個亞基得到非常好的分離。放大28+質譜峰可見三組樣品（對照，50 ppm H2O2和500 ppm H2O2強制氧化樣品）質譜峰基線完全分離，電荷價態可識別，BioPharma Finder軟體用Sliding window xtract算法對他們進行去卷積，得到各亞基單同位素分子量和檢測到Fc/2亞基的氧化形式。
肽段水平氧化翻譯後修飾的鑑定：如下圖所示，檢測到重鏈胰酶酶切肽段DTLMISR上發生約+15.9949 Da的質量差值，表明強制氧化的樣品甲硫氨酸上發生氧化修飾。發生修飾和未發生修飾的樣品一級質量精度高，質量偏差均小於1ppm。二級譜圖中特徵碎片y5和y6離子能確定氧化修飾發生的位置，以及譜圖中中性丟失64 Da (CH3SOH)碎片離子進一步提高結果的可信度。
肽圖水平氧化翻譯後修飾的鑑定結果跟完整蛋白，亞基水平氧化翻譯後修飾結果相互驗證、相互支持。Biopharma Finder軟體自動計算出ipilimumab 和 golimumab氧化修飾比例。在ipilimumab高濃度的雙氧水中甲硫氨酸氧化修飾比例都增加，從4個甲硫氨酸氧化發生的比例和氧化速率的不同，可以推測Fc端更多暴露在單抗的外表面，從而更容易被氧化。
小結：240質譜提供在完整蛋白、亞基和肽段水平上可信的檢測和監測單抗的CQAs平臺，操作簡單，質量準確性高。在完整的單抗水平上，對大多數的糖基化修飾的完整蛋白分子量的質量偏差小於4 ppm。通過與BioPharma Finder 4.0軟體相結合，使用滑動窗口和Xtract去卷積算法能夠快速、可信的對單抗亞基和低水平內源性氧化翻譯後修飾質譜數據去卷積，得到單同位素峰分子量。肽段鑑定一級質量精度高，一級質量偏差小於1ppm，鑑定結果可信可靠。
此外，值得一提的是從控制儀器，數據採集，數據分析和生成報告都可以在變色龍軟體中進行，對於後續將Exploris 240用於QC分析提供保證，該平臺符合法規的要求。
結語：在生物藥發現、開發、CMC和QC不同階段對質譜需求不同，orbitrap高分辨質譜在生物製藥各個環節都有完整的解決方案。Exploris 240優異的性能使得能對生物藥更加全面和深度的表徵，在生物藥的檢測和監測中得到更加優異的數據，同時還能減少分析時間，帶給用戶更優越的分析性能和體驗。
如需合作轉載本文，請文末留言。