不停歇的蛋白質組學分析:賽默飛全新一代Exploris 240質譜

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周嶽 黃敏

引言

Orbitrap Exploris 240新產品的到來，進一步拓展了超高分辨質譜在蛋白質組學領域的產品線，同時也為我們帶來全新的蛋白質組學體驗。

一． Exploris 240在蛋白質組學應用概覽

Exploris 240是四極杆和超高場Orbitrap的串聯質譜，解析度最高可達240,000，掃描速度高達22Hz，在蛋白質分析的功能上支持APD（Advanced Peak detection）算法；R 45000用於TMT 11plex和TMTpro（16plex）的分析；兼容FAIMS Pro離子淌度接口；支持DDA, DIA, PRM, t-SIM多種掃描模式；通過Biopharma option的擴展m/z 至8000用於完整蛋白分析；Easy IC的實時內標校正模式使質量軸穩定在1ppm。

圖1. Orbitrap Exploris 240 MS

超高場 Orbitrap 分析器

質量範圍：m/z 40-6000

質量精度內標 <1ppm，外標 <3ppm，Easy IC 實時內標校正

最高解析度 > 240,000

掃描速度高達 22 Hz

掃描模式：FS, t-SIM, DDA TopN, DDA TopTime, DIA, t-MS2 (PRM), AIF

高級掃描模式：AcquireX, APD, TMT @ 45k

選配：FAIMS Pro，Biopharma option

Exploris 240應用於蛋白質組學分析的設計理念

Exploris 240質譜平臺上融合了蛋白質組學積累的先進技術和工作流程，通過打包的方式呈現給用戶。Exploris 240可以開展基於DDA的蛋白質鑑定和定量流程，基於DIA的定量流程，TMT的定量流程，基於PRM的靶向蛋白定量流程，這些工作流程都以方法模板的形式內嵌在質譜方法中，操作人員只需要針對特定的實驗設計選擇對應的方法即可。同時Exploris 240延續了Exploris 480穩定的硬體設計，可以無間斷分析臨床大隊列樣本。

圖2. Orbitrap Exploris 240 質譜儀-領先的性能，多功能性和易用性

二． Exploris 240蛋白質組學工作流程

1、深度、快速蛋白質組覆蓋

全球組學應用開發團隊對不加FAIMS Pro的4臺Exploris 240進行蛋白鑑定數目測試（1g Hela酶切肽段，60分鐘梯度），4臺Exploris 240蛋白鑑定數目均在5300個蛋白以上（圖3），顯示出儀器間具有很好的重現性。

圖3. Exploris 240在1 g Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色譜柱，不加FAIMS Pro的情況下肽段和蛋白鑑定數目

Exploris 240加載了FAIMS Pro 後，蛋白質組的覆蓋深度進一步提高，蛋白鑑定數目可提高25%。1小時梯度，1g Hela酶切肽段中蛋白鑑定數超過了6000個蛋白。

圖4. Exploris 240在1 g Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色譜柱,不加裝FAIMS Pro，FAIMS單電壓CV (-45V), FAIMS雙電壓 (-50/70V)的條件下肽段和蛋白鑑定數目

接著對不同梯度的200ng Hela進行蛋白鑑定深度測試，30分鐘可鑑定3432個蛋白，60分鐘可鑑定5064個蛋白，90分鐘可鑑定5986個蛋白，120分鐘可鑑定6335個蛋白。

圖5.Exploris 240在200ng Hela酶切肽段, 不同色譜梯度, Top 20 method，Ionopticks 25cm column，FAIMS雙電壓(-50/70V)的條件下肽段和蛋白鑑定數目

繼續對不同濃度的Hela酶切肽段進行測試，Hela的濃度範圍從10ng到1000ng，跨越3個數量級，在每個濃度下Exploris 240均能獲得驚人的蛋白鑑定數。即使在10ng低濃度的上樣量的情況下，Exploris 240仍然能夠鑑定1600個蛋白。

圖6. Exploris 240在不同濃度HeLa digest，90min色譜梯度，FAIMS Pro 2 CV (-50/-70)， Ionopticks 25cm column， Proteome Discoverer 2.4 Mspep譜圖庫檢索，1%FDR的肽段和蛋白鑑定數目

需要注意的是，FAIMS Pro在多肽分離上具有完全正交性，如圖7所示，200ng Hela 30min梯度-50V和-70V鑑定到的肽段中只有3%的肽段是重複鑑定的。

圖7. 200ng Hela, 30min梯度CV -50V和-70V的肽段的Overlap圖，只有3%肽段重複鑑定

此外，針對很多蛋白質科學平臺老師日常工作中常見的IP蛋白鑑定樣品，Exploris 240可以將IP樣品分析的時間縮短至30分鐘。免疫富集AKT/mTOR通路中12個蛋白的樣品在30分鐘梯度內就可以鑑定到超過1600個蛋白，大大縮短了分析的周期。

圖8. 高通量IP蛋白鑑定。免疫富集 AKT/mTOR通路的12個蛋白，進行蛋白酶切，使用15min和30min梯度蛋白質鑑定

2、深度、精確蛋白質定量

定量蛋白質組學是蛋白質分析的必備手段，Exploris 240可實現非標記定量（圖9），DIA定量，TMT定量（圖10）和PRM靶標定量（圖11）4種模式，滿足定量蛋白質組學分析的多種需求。Exploris 240源於Orbitrap的定量技術，定量性能可達amol級別靈敏度，並實現 5個數量級的線性範圍。

圖9. Exploris 240非標記定量性能。兩種蛋白質混合物的精確非標記定量。酵母蛋白消化液以1:10,1:5,1:2的比例加入到200 ng Pierce HeLa消化液標準品的背景中。在Orbitrap Exploris 240 質譜上對兩種蛋白混合物進行分析，然後在Proteome Discoverer2.4軟體中使用Minora feature detector 模塊進行LFQ數據處理。

圖10. 基於TMT的高準確度定量的可重現性。A) 在帶有FAIMS Pro接口的Orbitrap Exploris 240 質譜上使用兩種補償電壓(-50和-70 CV)，對500ng TMT 11plex 標記的酵母消化標準品進行60分鐘梯度的定量分析。該標準樣本為用戶提供了一個工具，用於不同儀器測量TMT方法的準確性、精密度和蛋白質組深度的考察。B)所示的是FDR卡值為1%以下的蛋白質和多肽的定量數量。C)所有重複的無幹擾指數均達到75%。

圖11. Exploris 240準確的PRM定量性能。Pull-down AKT/mTOR通路的12個蛋白，加入AKT/mTOR SureQuant kit輕標和重標肽段，含有30個高純度的重標和輕標肽段，進行PRM定量分析。83%肽段CV<10%，可達5個數量級的動態範圍。

3、應用於臨床大隊列分析

蛋白組大隊列分析是很多臨床和轉化醫學實驗室的訴求，Exploris 240繼承了Exploris 480穩定和易用的硬體設計，真正做到不停歇的蛋白組分析。蛋白質組分析流程，自動化的樣品前處理每天可以處理500個樣本，高通量的LC-MS分析可以實現60個樣品/天的通量。

圖12. 大規模臨床隊列分析實驗流程。自動化的樣品前處理酶切方法每天可以處理500個樣本，1臺Exploris 240可以實現60樣品/天的分析速度，分析1000個樣品只需要18天的機時。同時不同Exploris 240質譜之間數據結果具有高度一致性，實現多臺質譜同時分析。

Exploris 240可以加配FAIMS Pro離子淌度接口，質譜分析中，FAIMS Pro只選擇特定的肽段離子進入質譜，阻擋了很多幹擾物離子，大大縮短儀器的維護周期，用戶只需要定期對FAIMS Pro進行維護即可，而維護FAIMS Pro只需要短短半個小時的時間。同時比較了在清洗FAIMS Pro前後，TMT標記的蛋白鑑定數目和IFI指數幾乎一致，用戶無需擔心維護FAIMS Pro會導致實驗重現性的差異。

圖13. FAIMS Source Pro易於安裝和維護，同時支持氣相分離，並通過去除汙染物提高了儀器的可靠性。在清洗FAIMS Pro前後，蛋白的鑑定數目和共隔離指數一致。

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