昆明石杉,系石杉科石杉屬植物，為我國特有種，主要分布於雲南、貴州等地，生於灌木下、苔蘚叢中。20世紀80年代，我國科學工作者從同屬植物蛇足石杉中分離到石杉鹼甲(Hup-A)，並闡明它是一種可逆性乙醯膽鹼酯酶抑制劑，對治療重症肌無力、記憶力減退和早老年痴呆具有較好的效果，現已被廣泛應用於臨床。為了科學、合理地利用石杉屬植物資源，本實驗首次採用HPLC法對昆明石杉中石杉鹼甲的含量進行測定，為尋找和篩選石杉鹼甲新的植物資源提供科學依據。
1、儀器與試藥
Aigent1100型HPLC色譜儀(帶四元泵，自動進樣器，紫外檢測器等);電子分析天平(日本島津);KQ50B超聲清洗器(崑山市超聲儀器有限公司);電熱恆溫水浴鍋(上海醫療器械廠);石杉鹼甲對照品(中國藥品生物製品檢定所，批號：100243-200401);乙腈(色譜純);二次重蒸水;其他試劑均為分析純。
實驗藥材採至貴州黔東南，由貴州科學院生物研究所王培善教授鑑定為昆明石杉H.kunmingensisChing.，標本存放於貴陽中醫學院民族醫藥研究所，標本憑證(20056)。
2、方法與結果
2.1色譜條件
ZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)，檢測波長為310nm，流速1ml·min-1，柱溫25℃，進樣量為5μl。在此色譜條件下，樣品中的石杉鹼甲與其他峰能達到基線分離，其理論塔板數為4656，對稱因子為0.92。石杉鹼甲的保留時間為11.15min，對照品與樣品的色譜圖見圖1。
2.2樣品的製備
精密稱取實驗藥材細粉2g於500ml的圓底燒瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，棄去濾液。濾渣再用95%的甲醇提取3次，合併濾液並回收溶劑，加入2%的酒石酸溶解，用氨水調節pH值至8.0，再用氯仿萃取至Dragendorffors反應呈陰性，揮幹有機溶劑，用無水乙醇溶解並定容至25ml即得。
2.3線性關係的考察
精密稱取石杉鹼甲對照品2.40mg於25ml容量瓶中以無水乙醇溶解並定容，得濃度為0.096mg·ml-1對照品溶液，再分別稀釋成0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的對照品供試液，在色譜條件下測定。以進樣濃度對峰面積進行回歸，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995。可知石杉鹼甲在0.015～0.48μg之間與峰面積呈良好線性關係。
2.4精密度實驗
取石杉鹼甲對照溶液，在色譜條件下重複進樣6次，結果石杉鹼甲峰面積的RSD為0.36%(n=6)。
2.5穩定性實驗
取供試品溶液，每隔2h測定1次，考察石杉鹼甲的含量變化，結果含量的RSD為0.85%(n=6)，表明供試品在10h內穩定。
2.6重複性實驗
稱樣品6份，按「2.2」項的要求製備6份供試液，在色譜條件下分別進行測定，結果Hup-A含量的RSD為0.60%(n=6)。
2.7回收率
實驗精密稱取昆明石杉藥材細粉6份，每份1g，分別加入對照品供試液(0.003mg·ml-1)100ml，按樣品製備方法和色譜條件，製備加樣回收供試液進行測定，計算回收率(見表1)。結果石杉鹼甲的平均回收率為99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉鹼甲加樣回收率實驗結果(略)
2.8樣品的測定
按「2.2」項的要求精密稱取樣品3份，製備供試液，按色譜條件進行測定，重複3次，取平均值，石杉鹼甲在原植物中的平均含量為0.03%。
3、討論
首次採用HPLC法測定昆明石杉中石杉鹼甲的含量。
測定方法是在其它石杉中石杉鹼甲含量測定方法的基礎上，改用ZORBAXSB-C18色譜柱及以0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)為流動相。實驗證明該方法易行、靈敏、準確、可靠。在同科屬植物中，昆明石杉是石杉鹼甲含量相對較高的一個植物品種，達到0.03%。