作者：劉寧，王佐林，同濟大學口腔醫學院·同濟大學附屬口腔醫院種植科
口腔頜面部因創傷、腫瘤切除等原因造成的上皮組織和骨組織大面積缺損是頜面外科臨床常見病，採用組織工程方法構建再生組織被認為是未來進行缺損組織修復最有效的方法之一。組織再生過程受多種生長因子、細胞因子和趨化因子的調控，模擬生理狀態下組織修復與再生的微環境，局部釋放外源性生長因子促進組織再生是一種有效的再生修復手段。然而，模擬生理創傷癒合過程促進組織再生的方法不應僅限於釋放一種生長因子，而應該按生理劑量、最佳比例、順序甚至時空來釋放多種生長因子。
儘管目前多種生長因子的生物控釋面臨很多困難與挑戰，但對於嚴重受損組織的修復與再生具有廣闊的臨床應用前景。本文對多種生長因子釋放系統在組織工程領域的研究進展作一綜述。
1.多種生長因子的必要性及相互作用
生長因子是一類多功能調節多肽，在細胞間起信號傳遞作用，有調節細胞黏附、生長、增殖以及細胞外基質合成的作用，是組織修復的基本調節者。組織修復與再生過程中通過外源性釋放某一種生長因子而使其產生有效作用，往往需要釋放超過生理劑量的生長因子，其安全性尚值得商榷。基於目前對組織再生的認識，多種生長因子的協同作用，可以使其在生理劑量上發揮有效作用，更好地在細胞和分子水平上促進組織的癒合與再生。然而，生長因子的選擇及釋放序列對其作用的發揮具有重要影響。Chaudhary等將人骨髓間充質幹細胞（human mesenchymal stromal cells,hMSCs）在分別含有骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein，BMP-7）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、鹼性成纖維細胞生長因子（bone fibroblast growth factor，bFGF），以及同時含有FGF-2和BMP-7的培養基中培養。結果顯示，PDGF和FGF-2不能單獨誘導成骨，BMP-7促進hMSCs成骨分化，而FGF-2會抑制BMP-7促進成骨分化的作用。
Langdahl等研究結果顯示無論是單獨使用胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ）還是與人生長激素（human Growth Hormone,hGH）聯合應用，或hGH-IGF-Ⅰ序列應用均能促進hMSC增殖。對於促進成骨分化，3種使用方式（IGF-Ⅰ單獨應用、與hGH聯合或序列應用），都能降低hMSCs中ALP含量。目前對各種組織再生過程中每一階段發揮作用的具體生長因子還不夠明確，不恰當的將生長因子聯合應用會激發多重信號的級聯反應，產生與預期相反的結果。因此生長因子的選擇、濃度和釋放序列的確定是多因子控釋系統的重點。
2.多種生長因子釋放策略
2.1直接結合
生長因子與聚合支架材料直接結合最簡單的方式是，在聚合材料未固化前將生長因子與聚合材料的基質進行混合，然後再對此混合物進行固化。但是這種結合方式可能會因為固化工藝步驟導致生長因子的化學結構和生物性能發生改變，從而影響生長因子發揮其生物效應。另一種直接結合方式是，將生長因子通過物理吸附作用結合到已固化的支架材料上，這既可以保留生長因子的生物活性，又不會影響支架材料的優越性能。然而這種結合方式存在的問題是，其蛋白結合率和蛋白釋放率可控性較差。一旦支架材料的組成成分、孔隙大小、孔隙率和機械性能形成，其生長因子的結合律、釋放率也將確定。但這種直接物理結合的方式在手術過程中很容易實現，發現一種既具有良好支架性能又符合生長因子釋放需要的支架材料就顯得非常重要。
目前，已對臨床中常用支架材料與生長因子直接吸附結合後生長因子的釋放率進行了檢測。如：脫礦骨基質、Bio-Oss骨粉、可吸收明膠海綿、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）和水凝膠等材料。其中，可吸收明膠海綿、水凝膠、PLGA支架材料被證實是有效和安全的載體材料。Bhargava等報導直接吸附肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和PDGF的明膠海綿或水凝膠支架材料可以促進半月板損傷的修復。而將PDGF與Bio-Oss骨粉在手術過程中直接混合應用於骨缺損處是目前口腔領域臨床中常用的促進骨再生方法。儘管這種多生長因子通過物理吸附作用直接負載到支架材料上是一種最簡便的方法，但這種結合方式並不能控制生長因子按照一定比例和速率同時或連續釋放。
2.2層層自組裝技術
層層自組裝技術，是基於帶有相反電荷的聚電解質層與生長因子層之間的相互靜電作用而形成的，一種可控制生長因子釋放時間和速率的方法。當一個基片交替地在一個陽離子溶液和一個陰離子溶液中浸泡時，陰陽離子聚電解質就會在基片上一層一層地組裝起來。而在水環境中，層層自組裝塗層可逐漸解離，從而以既定速率釋放生長因子促進組織的再生。它具有一系列優點：①製備工藝簡單，通過簡單的交替浸塗技術即可實現在材料表面組裝；②製備條件溫和，可在常溫水溶液中進行，可以保證生物分子具有維持生物活性的天然構像。目前研究報導了可控釋放骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的雙塗層可注射羥基磷灰石支架材料，有望微創地注射到頜面部骨缺損處促進骨再生。而多明膠塗層可以模擬骨癒合期間生長因子的釋放模式來控制其釋放。例如：根據骨癒合過程中生長因子釋放曲線隨時間的改變，層層自組裝明膠塗層可以使生長因子按照3個不同的釋放速率釋放。在最初的2d內，生長因子快速釋放，接下來的5d，生長因子釋放速率逐漸平穩，以恆定的速率緩慢釋放，最後幾天生長因子再次進入快速釋放階段。層層自組裝技術還可以針對特殊的細胞和組織，將多種功能性蛋白和基因塗覆於組織工程支架材料上，通過控釋放來促進組織的再生。
2.3多相包埋
組織工程的一個關鍵原則就是支架材料可以行使生物力學和生物化學的雙重作用。首先，要作為細胞黏附和滲透的支架材料，其次，要作為一個傳遞多種生長因子的媒介來促進組織的再生。多相包埋符合此要求並且可以釋放2種或多種生長因子。Richardson等首次報導一種含有游離生長因子和微球控釋生長因子的支架材料，能以不同速率釋放VEGF和PDGF兩種成血管生長因子。這種支架材料是通過將游離VEGF與負載PDGF或不負載PDGF的PLAG微粒混合，然後將它們組裝成多孔的支架材料。這種加入VEGF的方法使得生長因子與聚合體表面廣泛結合，從而快速釋放。
相比之下，PDGF是通過聚合體降解釋放，釋放速率更緩慢。類似地，將負載神經營養因子3（neurotrophins-3，NT-3）的PLGA微粒加入含有睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）的可降解水凝膠中，實現CNTF的快速釋放和NT-3的持續緩慢釋放。Charles等發現將含有FGF-2的水凝膠注入含有BMP-2的膠原羥基磷灰石支架材料中，可以促進老年大鼠顱骨缺損模型中骨的再生。許多體外和體內實驗研究報導了應用多相包埋技術合成支架材料釋放多種生長因子，因此多相包埋技術為以不同速率釋放多種生長因子提供了一種有效的新方法。
2.4微球-三維支架複合體系
為了滿足組織再生不同階段對多種生長因子的需求，將負載生長因子的微球和組織工程三維支架複合得到的微球—三維支架複合體系，能夠實現多種生長因子的同時釋放或依次釋放。生長因子緩釋微球是將生長因子包封於粒徑為0.1~250μm的多孔微球中，通過改變微球的交聯度和降解速率從而精確調控各種生長因子釋放速率。微球結構可以保護生長因子免受外界環境的破壞且性能穩定，因此吸引國內外學者對微球控釋系統深入研究並將其引入組織工程領域。用作微球的材料主要有脫乙醯殼多糖、明膠、藻酸鹽、多糖基水凝膠以及聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物等。
微球中生長因子的釋放主要有3個階段：①突釋階段，微球表面的微孔迅速吸水溶脹，致其表面的生長因子快速溶解釋放。②緩慢釋放階段，生長因子隨微球的逐漸降解而釋放，但聚合物相對分子質量沒有降低到可以加速生長因子的擴散釋放。③快速釋放階段，聚合物相對分子質量降解到足夠低，剩餘的生長因子隨著聚合物的侵蝕崩解而大量釋放。生長因子在釋放早期的突釋效應，導致大多數生長因子在短期內快速釋放，而在隨後的慢速釋放階段達不到有效地治療質量濃度。微球—三維支架複合體系的製備使生長因子的釋放受到微球和支架材料生物降解的雙重作用，初期釋放為微球—三維支架複合體系與外部的釋放液相接觸，能夠減緩生長因子的初始突釋，方便地調節所需的釋放行為。研究報導將不同釋放速率的明膠微球附載到三維支架材料上，按一定時序釋放轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IGF-Ⅰ，可以促進軟骨組織再生。三維支架材料上負載BMP-2和IGF-Ⅰ兩種生長因子的微球系統，可以促進牙周膜幹細胞的黏附、增殖、代謝和成骨分化。
研究結果顯示釋放VEGF和BMP-2兩種生長因子的微球，可以促進鼠顱骨缺損的再生，且通過微球控釋系統以不同速率同時釋放多種生長因子還可以促進血管、皮膚織再生。微球—三維支架控釋系統中的微球可以向細胞和組織間定量、持續釋放各種生長因子，克服傳統支架材料釋放速率不可控的缺點，使生長因子與周圍組織和細胞均勻接觸，有利於細胞的增殖和分化。同時，包載微球的三維支架材料可以在損傷部位組織再生中起固定和支撐作用，因此微球—三維支架控釋系統是具有潛力的用於頜面部骨、皮膚缺損修復的多因子載體。
2.5其它釋放策略
微粒表面改性是藥物控釋領域中的一項重要進步，將攜帶蛋白的微粒轉變成特定的傳輸系統，從而提高其與組織和細胞之間的相互作用。有的表面改性研究將靶向抗體、細胞吸附配體結合到材料表面從而促進材料的生物相容性或者生長因子在組織中的擴散。還可以通過共價鍵將蛋白結合到載體表面，從而控制蛋白的含量和分布，促進生長因子濃度梯度的形成。另一種釋放策略是通過化學修飾生長因子來調節固有蛋白的特性或蛋白-載體的相互作用，例如衍生、二聚體形成、酶切重組蛋白等。以上策略可以釋放多種生長因子，滿足組織再生的特殊需求。
綜上所述，組織再生治療是今後口腔醫療領域的發展的必然方向。生長因子是組織再生修復治療的關鍵組成部分，本篇綜述介紹了在組織再生過程中多種生長因子釋放的必要性及相關釋放策略。多種生長因子的釋放應根據不同組織的特點，在生長因子作用的不同階段，適時的釋放複合效應濃度的生長因子。然而目前多種生長因子控釋系統向臨床的轉化仍面臨很多困難和挑戰，如不同因子的篩選與組合、劑量和控釋標準、量效、時效關係等問題。符合臨床應用的多因子控釋體系的研發具有重要的臨床意義和廣闊的應用前景，需要跨專業、多學科研究人員的共同努力來實現。
來源：口腔頜面外科雜誌2016年4月第26卷第2期
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