英國帝國理工大學的Chunching Li（共同一作），歐陽禮亮（共同一作），James Armstrong（共同通訊）和Molly Stevens（共同通訊）近期在Trends in Biotechnology期刊上發表了關於梯度生物材料製備的綜述--「Advances in the Fabrication of Biomaterials for Gradient Tissue Engineering」
Highlights：最近使用梯度生物材料複製關鍵的發育過程或功能角色的組織工程方案的數量激增。增材製造的最新進展（例如3D生物列印，微流體技術）已導致自下而上的梯度生物材料製造中結構的複雜性增加。越來越多的報告正在尋求使用施加力來重新分配均相系統的組件，以製造具有良好積分梯度的生物材料。少數近期研究通過控制水凝膠交聯過程中的溫度或光照來製造梯度生物材料。最近的報導表明，通過使用基於溫度，光或擴散的機制對預製的水凝膠或固體支架進行後改性，可以製造出梯度生物材料。
背景
天然組織和器官表現出一系列的空間梯度，從胚胎發育過程中的極化神經管到關節關節處存在的骨軟骨界面。這些異質組織中強大的結構-功能關係激發了對可在工程組織中複製生理梯度的方法開發的深入研究。在這篇綜述中，作者考慮了天然組織中存在的不同梯度，並討論了它們在功能組織工程中的至關重要性。在此基礎上，作者將現有的製造方法整合為四類：增材製造，組件重新分配，受控相變和後改性。並通過最近的示例進行了說明，突出了該領域的突出趨勢，並概述了梯度製造的一組標準和前景。
圖1.四種梯度構建策略
增材製造
增材製造是梯度製造的一種直觀方法，其方法包括順序分層，3D列印，受控流體混合和靜電紡絲。
圖2. 增材製造梯度材料結構
（A）骨軟骨組織使用間充質幹細胞進行工程處理，該細胞接種在具有低，中和高負荷礦化肽（R5）的連續分層支架上。圖像顯示蘇木精和曙紅（H＆E），von Kossa和組織切片的Sirius紅染色。（B）具有組成梯度的3D列印支架，使用微流體列印頭在擠出前可控地混合溶液組分。 （C）（i）使用基於閥的流動聚焦微流體裝置製造孔隙率具有建築梯度的支架，以產生具有可調氣泡大小的明膠和納米羥基磷灰石（nHAP）複合泡沫。使用微計算機斷層攝影術對所得的（ii）多層和（iii）梯度多孔材料進行3D重建。 （D）（i）由兩種不同的可生物降解的聚（氨基甲酸乙酯尿素）（BPUR）纖維製成的具有組成梯度的電紡支架。（ii）跨隨機和對齊的梯度支架的不同區域的掃描電子顯微照片。
組件的重新分布
組件的重新分布方法是通過對流拉伸，浮力，磁場或電場通過受控的混合，從最初的均勻分布中產生梯度。
圖3. 組件的重新分布方法構建梯度材料結構
（A）（i）通過顆粒對流形成的糖顆粒（灰色）的梯度將具有孔徑在結構上梯度的支架作為模板。在添加並交聯包含季戊四醇（PE），癸二醯氯（SC）和聚（ε-己內酯）二醇（PCL）的聚合物前體溶液（藍色）後，將模板溶解，並在其中接種人胰島（綠色）產生的毛孔。（ii）在整個支架中保留的具有不同模板大小範圍的人類胰島的數量。（B）（i）骨軟骨組織，使用人間充質幹細胞（hMSC）負載明膠甲基丙烯醯（GelMA）水凝膠進行工程改造，並具有浮力以形成與甲基丙烯酸肝素複合的骨形態發生蛋白2（BMP-2）的形態發生梯度。（HepMA）。所得組織用（ii）茜素紅S染色以顯示礦化帽的存在，以及（iii）阿爾辛藍染色以可視化硫酸化糖胺聚糖的分布。 （C）（i）在電場作用下，富含β-摺疊的絲素蛋白納米纖維（BSNF）通過水凝膠前體的遷移而產生的細胞支持性梯度生物材料。（ii）梯度，載絲的GelMA水凝膠均分為四個區域（稱為MGH-M1，MGH-M2，MGH-M3，MGH-M4）。在這四個區域上進行的壓縮測試表明，壓縮模量存在機械梯度。（iii）在無定形絲素蛋白納米纖維（ASNF）水凝膠和梯度絲素蛋白納米纖維（GSNF）不同區域成骨分化28天後，間充質幹細胞中Runt相關轉錄因子2（RunX）和骨鈣蛋白（OCN）的基因表達）水凝膠。* P≤0.05，** P≤0.001。縮寫：BMSC，骨間充質幹細胞
受控的相變方法
受控的相變可以導致從均質的起始材料形成梯度，通常使用逐步暴露於熱或光的情況。
圖4. 受控的相變方法構建梯度材料結構
（A）（i）使用梯度光掩模製備漸變光可交聯生物材料。（ii）對所得材料進行光學相干彈性成像和（iii）孔徑測量，分別測量機械梯度（剛度）和建築梯度（孔隙度）。（iv）封裝在梯度GelMA水凝膠中的脂肪幹細胞的形態。 （B）（i）通過在熱梯度下對澱粉和聚乙烯醇（PVA）複合水凝膠進行冰模板處理製成的支架。（ii）如通過（iii）掃描電子顯微照片的圖像分析所確定的，所得的複合材料在孔寬度上顯示出結構梯度。（ii）中的節號指的是從（iii）所示區域獲得的測量值。
後改性方法
後改性涉及在預製材料上呈現梯度，通常是通過受控的組分擴散或光圖案化來實現的。
圖5. 後改性方法構建梯度材料結構
（A）（i）通過將雙功能交聯劑和信號量3A（Sema3A）依次擴散到Matrigel水凝膠中製備的梯度生物材料，並用於體內植入。（ii）螢光圖像顯示已經遷移到梯度水凝膠不同區域的Nestin +（綠色）和雙皮質素陽性（DCX +；紅色）細胞的分布。 （B）（i）通過HAV和RGD肽的順序光致交聯將正交梯度圖案化為降冰片烯官能化的透明質酸（NorHA）水凝膠，並使用滑動光罩控制曝光。（ii）用若丹明標記的RGD（紅色）和螢光素標記的HAV（綠色）對正交梯度進行螢光成像。（iii）顯示正交梯度調節Sox9的表達（藍色）和聚集蛋白聚糖（紫色）的合成。指示的值基於標準化強度。
梯度生物材料製備標準
本綜述中討論的方法各有其優缺點（表1）。考慮到這些因素，在設計用於梯度組織工程的製造策略時應採用幾個原則。
第一個標準是重新創建生物學相關的資料。通常由順序分層方法形成的階梯式過渡可能適合某些組織工程場景，例如骨軟骨組織中的骨-軟骨界面。但是，連續過渡與大多數自然系統具有更大的相關性，從而可以改善負載傳遞，並避免出現機械不穩定或不包含單元的界面。
第二個標準是生成複雜梯度的能力。許多策略（例如使用重力或浮力的策略）僅限於形成單個線性梯度。相比之下，自然系統通常會沿不同的結構軸（例如，神經管中的背腹和前後圖案）或非線性結構（例如，血管壁的徑向過渡）表現出梯度。這些系統可能會受益於諸如3D列印之類的方法或多種技術的組合所提供的更大的設計靈活性。可以設想其他收斂方法，例如3D列印過程中的冰模板梯度或通過順序磁場吸引和分級光交聯形成雙重梯度的方法。
第三個標準是產生動態梯度的能力。天然系統在形態發生素梯度剖面中表現出動態變化，特別是在發育的不同階段。這是基於生物材料的策略的主要挑戰，該策略通常限於簡單的緩釋形態發生劑梯度。細胞分泌的酶已被用於響應表型變化而降解材料，並且可以使用類似的方法來釋放形態發生劑梯度，以適應組織的發育和成熟。
第四個標準是無障礙設備的使用。協議的廣泛採用可能會因某些技術（例如生物列印，微流體技術，雙光子雷射掃描）的專業知識和高昂的成本而受阻。通過使用標準實驗室設備（例如離心機），發布詳細的規程文件以及專用技術（例如梯度儀）的商業化，可以實現更大的可及性。
第五標準是系統的多功能性。使用單個材料，分子或組織演示了許多漸變製造「平臺」。但是，可以更廣泛地應用於不同系統的技術將能夠滿足更廣泛的用戶群的需求。在這方面，理想地，梯度製造不應受到特定材料特性（例如，光響應性，粘度，磁性）的約束。
第六條系統的可重複性和魯棒性。在所報告的條件下，任何科學方法均應具有可重複性；但是，梯度製造不限於狹窄的參數空間也很重要。理想情況下，標準化協議應用於製造，其關鍵質量屬性用於評估系統處理變更的容忍度。這與最後一個標準相關：系統可伸縮性和吞吐量。應始終評估的關鍵工藝變化是縮放：所選製造平臺是否能夠大規模生產梯度材料？在這方面，高度自動化，快速且可重現的系統通常將實現轉化應用所需的高通量製造。
表1 各梯度製備方法優缺點
總結
組織工程界完全專注於開發可重新創建天然組織的複雜體系結構的方法。在這裡，作者概述了製造天然組織中存在的不同梯度的方法：細胞，成分，建築，機械和形態發生素。作者已經基於不同的梯度製造策略的基本原理提出了一種新的分類系統：增材製造，組件重新分配，受控相變和後改性。本綜述中提出的許多研究都集中在骨軟骨組織工程上，其中梯度生物材料用於體外骨骼和心臟組織工程以及體內神經再生。在考慮目標組織和應用的特定要求之後，應選擇和調整這些不同的方法。新方法的不斷探索，為此，作者提出了一套理想的梯度製備標準：產生生物學相關，複雜和動態梯度的能力，廣泛使用的設備的使用以及系統的多功能性，可重複性和健壯性。作者希望這篇評論會幫助並激發那些尋求開發新的梯度生物材料製造方法的人，以及那些將現有技術應用於工程梯度組織的人。
參考文獻
Li C , Ouyang L , Armstrong J P K , et al. Advances in the Fabrication of Biomaterials for Gradient Tissue Engineering[J]. Trends in Biotechnology, 2020. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2020.06.005