【前沿背景】
炎症反應是典型傷口癒合的關鍵階段。儘管已有研究報導某些生物活性物質可以調節巨噬細胞的極化，從而有利於組織再生，但炎症反應的作用，尤其是巨噬細胞在生物物質刺激的組織再生中的關鍵作用尚不清楚。據報導，生物活性玻璃（BG）和含有BG的水凝膠能夠促進硬組織和軟組織的再生。但是，尚未完全闡明巨噬細胞在由BG增強的組織再生中的關鍵作用。
【科研摘要】
近日，上海交通大學李海燕教授攜手香港中文大學陳漢輝教授在7月生物材料頂刊《Biomaterials》發表了題為「Modulation of macrophages by bioactive glass/sodium alginate hydrogel is crucial in skin regeneration enhancement」論文。研究了BG /海藻酸鈉（SA）水凝膠（BG/SA水凝膠）對巨噬細胞行為以及巨噬細胞與修復細胞之間相互作用的影響。此外，用巨噬細胞耗竭的小鼠來研究巨噬細胞在用BG/SA水凝膠處理的全層皮膚傷口再生中的必要性。結果表明，BG/SA水凝膠可在體外和體內使巨噬細胞向M2表型極化，並上調抗炎基因的表達。此外，M2極化的巨噬細胞可以進一步募集成纖維細胞和內皮細胞，並在體外和體內增強成纖維細胞的細胞外基質（ECM）合成和內皮細胞的血管化。傷口部位巨噬細胞的耗竭阻礙了修復細胞的募集，並減少了血管和ECM的形成，減慢了皮膚的再生。這些結果提供了對生物材料-免疫系統相互作用的見解，並證明了BG/SA水凝膠在炎症反應中對巨噬細胞的調節對於水凝膠增強皮膚再生至關重要。
【圖文探討】
3.1 BG/SA水凝膠對RAW細胞極化的影響
通過流式細胞儀檢測表達M1標誌物iNOS和M2標誌物ARG的巨噬細胞，以研究BG/SA水凝膠對巨噬細胞極化的影響。從圖1可以看出，BG/SA水凝膠激活了RAW細胞的M2表型，這是在BG/SA水凝膠培養的總細胞中表達ARG標誌物的細胞所佔的百分比（12 h 為64.8％±4.3％，和24 h時為88.1±5.9％）高於對照組（12 h時為48.2±3.5％和24 h時為48.6±2.7％）。
圖1.在12小時和24小時後，用正常培養基（對照）和BG/SA水凝膠培養的RAW細胞的FACS結果。
3.2 BG/SA水凝膠對RAW細胞炎症相關細胞因子基因表達的影響
分析了在有或沒有BG/SA水凝膠培養12 h和24 h的RAW細胞中幾種關鍵抗炎和促炎細胞因子的基因表達。圖2表明BG/SA水凝膠可以顯著激活M2表型的巨噬細胞，因為BG/SA水凝膠培養的RAW細胞中抗炎因子TGF-β，VEGF，bFGF，ARG和IL-10的基因表達顯著高於用對照培養基在12 h和24 h培養的RAW細胞中的細胞。這些結果與流式細胞儀結果一致。相反，在用BG/SA水凝膠培養的RAW細胞中，促炎細胞因子（例如IL-1β和TNF-α）的基因表達明顯低於在用對照培養基培養的RAW細胞中的表達。這表明BG/SA水凝膠可以抑制促炎細胞因子的分泌。
圖2.12小時和24小時後，BG / SA水凝膠和正常培養基（對照）培養的RAW細胞中IL-1β，TNF-α，ARG，IL-10，VEGF，TGF-β和bFGF的基因表達
3.3 不同條件培養基對L929和MAEC細胞遷移的影響
通過Transwell遷移和刮擦試驗研究了BG/SA水凝膠激活的巨噬細胞對MAEC（圖3A和B）和L929細胞（圖3C和D）遷移的影響。從圖3A中注意到，與其他條件培養基相比，在用CM-BG/SA培養後24小時，更多的MAEC細胞通過Transwell膜遷移。
圖3.用正常培養基（對照），BG/SA水凝膠（BG/SA），RAW細胞的條件培養基（CM）和用BG/SA水凝膠（CM）培養的RAW細胞的條件培養基培養的MAEC和L929細胞的遷移-BG/SA）。
3.4 不同條件培養基對L929和MAEC細胞組織再生相關分子表達的影響
評估了在不同條件培養基中培養的L929細胞中ECM蛋白的蛋白質和基因表達，包括膠原蛋白I（Col-I），膠原蛋白III（Col-III），彈性蛋白和纖連蛋白（FN），結果分別如圖4A和B所示。從圖4A可以看出，當用不同培養基培養L929細胞時，它們分泌了這些ECM蛋白。用三種條件培養基培養L929細胞時，分泌的Col-I，Col-III，彈性蛋白和纖連蛋白比對照培養基更多。但是，使用免疫螢光圖像很難區分這三個條件培養基組之間的差異。圖4B顯示，與用對照培養基培養的L929細胞相比，在用CM-BG/SA培養的L929細胞中這些再生相關分子的基因表達均被上調。在不同的條件培養基中，CM-BG/SA能夠增強L929細胞中所有四個基因（Col-I，Col-III，彈性蛋白和FN）的表達。相反，與對照培養基相比，在用其他條件培養基培養的L929細胞中再生相關基因的表達並未全部上調。結果表明，BG/SA提取物可以上調L929細胞中Col-I和FN的表達，而CM僅上調彈性蛋白的基因表達。在用CM和對照培養基培養的L929細胞中，Col-I，Col-III和FN的基因表達沒有明顯差異。因此，與其他條件培養基和對照培養基相比，CM-BG/SA對促進L929細胞的再生相關基因表達的作用最強。
圖4.用不同條件培養基培養的L929和MAEC細胞的行為。
3.5 巨噬細胞在體內 BG/SA水凝膠募集過程中對修復細胞的作用
3.5.2 在正常和巨噬細胞耗竭小鼠中，在BG/SA水凝膠募集下L929和MAEC細胞的遷移
圖5顯示了在不同條件下L929和MAEC細胞在體內的遷移。在正常小鼠中，GFP螢光圖像和免疫組織化學染色圖像均表明，向注入BG/SA水凝膠的位點遷移的L929細胞比向注入SA溶液的位點遷移的更多（圖5A）。MAEC獲得了相似的結果（圖5B）。在消耗巨噬細胞的小鼠中，GFP螢光圖像和免疫組織化學染色圖像均表明，向注射有BG/SA水凝膠的傷口部位和向SA溶液遷移的L929細胞數量之間沒有顯著差異（圖5C）。再次在巨噬細胞耗竭的小鼠中觀察到MAEC的相似結果（圖5D ）。
圖5. 正常小鼠和巨噬細胞耗竭小鼠中MAECs和L929細胞的遷移。
3.6 BG/SA水凝膠治療巨噬細胞在全層皮膚傷口再生中的作用
3.6.1 傷口閉合和HE染色
將BG/SA水凝膠和SA溶液應用於正常和巨噬細胞耗竭小鼠的皮膚組織損傷，以評估BG/SA水凝膠對傷口癒合的影響。皮膚傷口的總體觀察和傷口閉合率的代表性圖像分別在圖6A和B 中示出。用BG/SA水凝膠和SA溶液處理的傷口在不同時間點表現出不同程度的傷口癒合（圖6A）。用BG/SA水凝膠和SA溶液處理的正常小鼠的傷口癒合速度比消耗巨噬細胞的小鼠快，這表明巨噬細胞對於傷口癒合至關重要。圖6B進一步證實了這一發現，因為在所有時間點，巨噬細胞BG/SA組和巨噬細胞SA組的傷口閉合率均高於巨噬細胞-BG/SA組和巨噬細胞-SA組。另外，在正常小鼠中，巨噬細胞BG/SA組的傷口閉合率高於巨噬細胞SA組。相反，在消耗巨噬細胞的小鼠中，用BG/SA水凝膠（Macrophage-BG/SA）處理的傷口的閉合率與用SA溶液（Macrophage-SA）處理的傷口相似（圖6A和B）。
圖6. 傷口癒合有不同的治療方法。
3.6.2 BG/SA水凝膠對傷口部位巨噬細胞行為的影響
用BG/SA水凝膠或用SA溶液處理的正常和缺乏巨噬細胞的小鼠的傷口中的總巨噬細胞和M2巨噬細胞被分別標記，結果顯示在圖7中。圖7A顯示了在第3天和第7天，正常和缺乏巨噬細胞的小鼠傷口部位的總巨噬細胞的CD68免疫組織化學結果。圖像顯示，在巨噬細胞耗盡的小鼠的傷口部位觀察到的巨噬細胞少於傷口處的巨噬細胞。在BG/SA水凝膠或SA溶液組中正常小鼠的兩個部位，表明通過氯膦酸鹽-脂質體注射來清除巨噬細胞是有效的。重要的是，在消耗巨噬細胞的小鼠和正常小鼠中，用BG/SA水凝膠或SA溶液處理的傷口部位的總巨噬細胞數量沒有顯著差異。
圖7.在第3天和第7天，用BG/SA水凝膠或SA溶液治療正常小鼠和巨噬細胞衰竭小鼠的傷口中CD 68的免疫組織化學染色（用於鑑定通用巨噬細胞）和CD163（M163）用於鑑定M2表型巨噬細胞。
3.6.3 免疫組織化學染色
Masson染色用於在小鼠中用BG/SA水凝膠或SA溶液處理的傷口中的膠原蛋白染色。沉積的膠原蛋白在圖8中被染成藍色不僅提供有關膠原蛋白沉積的信息，而且還提供有關沉積膠原蛋白結構的信息。7天後，在BG/SA水凝膠或SA溶液組中，與正常小鼠相比，在巨噬細胞耗竭小鼠的傷口部位沉積的膠原蛋白更少。另外，在正常小鼠的傷口部位可見膠原纖維結構，但是在巨噬細胞耗竭的小鼠中很難觀察到。在消耗巨噬細胞的小鼠中，用BG/SA水凝膠和SA溶液處理的傷口部位之間的膠原沉積沒有顯著差異。相反，在正常小鼠中，與SA溶液相比，在用BG/SA水凝膠處理的傷口部位可以觀察到更多的藍色膠原蛋白染色。
圖8.在第7天和第14天，在正常小鼠和巨噬細胞耗竭小鼠中，用BG / SA水凝膠或SA溶液處理的傷口的Masson染色。
【陳述總結】
在這項研究中，已通過使用體外試驗和耗竭巨噬細胞的小鼠模型闡明了巨噬細胞在BG/SA水凝膠增強的皮膚傷口癒合中的關鍵作用。結果表明，當BG/SA水凝膠用於治療皮膚傷口時，巨噬細胞是必不可少的，因為在巨噬細胞耗竭小鼠中缺乏巨噬細胞會顯著阻礙BG/SA水凝膠介導的皮膚再生。當傷口處存在巨噬細胞時，BG/SA水凝膠可調節巨噬細胞的M2表型，從而分泌促再生細胞因子和趨化因子。然後，M2巨噬細胞可以將修復細胞，例如成纖維細胞和內皮細胞募集到傷口部位，並增強內皮細胞的血管生成和成纖維細胞的ECM分泌，從而促進肉芽組織的形成。在沒有巨噬細胞的情況下，BG/SA水凝膠可能會直接激活修復細胞，但由於在沒有M2巨噬細胞的情況下募集到傷口部位的修復細胞明顯減少，因此治療效果減弱。
【通訊簡介】
李海燕，現任上海交通大學生物醫學工程學院Med-X 研究院長聘副教授。2005年畢業於中國科學院上海矽酸鹽研究所生物材料與組織工程研究中心，獲材料工程學博士學位，導師為常江研究員。2005年7月至2006年3月就職於聯合利華中國研究所。2006年4月至2008年11月在澳大利亞莫那什大學(Monash University) 進行博士後研究。2008年12月至2011年2月在法國國家醫療與衛生研究所 (INSERM)生物材料與組織修復實驗室 (U1026) 進行博士後研究。2011年，李海燕加入上海交通大學生物醫學工程學院Med-X研究院並於2015年獲聘上海交通大學長聘教軌副教授。回國後，其先後承擔和完成3項國家自然基金面上項目以及多項上海市科研項目，獲得上海市2012年「浦江人才」獎勵以及上海交通大學2016年「晨星計劃」A類人才獎勵。其主要研究領域為生物材料與組織工程，共發表SCI論文70餘篇，2章外文專著及申請了8項專利，論文總引用次數約為2400次。在研究過程中，獲得12項基金資助，其中包括作為項目負責人的3項國家自然基金，作為合作申請者的2項上海交通大學醫工交叉重點基金，作為項目負責人的3項上海市基金等。目前主要研究方向是生物材料與組織工程，組織工程血管化，骨組織工程。
陳漢輝，香港中文大學（港中大）組織工程與再生醫學研究所和生物醫學學院的助理教授。他於2010年從香港大學獲得了學士學位。然後，他繼續攻讀碩士學位。在Sir Edward Youde Memorial Fellowships海外研究紀念獎學金的支持下獲得杜克大學博士學位。在他的博士學位期間在培訓中，他專注於開發幾種微流體技術來進行間充質幹細胞和肝細胞的3D球體培養，並研究了補充細胞外基質提示對球體功能的影響。2015年畢業後，陳漢輝在哥倫比亞大學（Columbia University）擔任了一年的博士後研究員。他使用微流體液滴對合成基因進行了高通量篩選，以優化蛋白質表達。2016年，加入麻省理工學院，擔任博士後助理。在那裡，他進行了片上器官研究，並開發了生物力學指導的摺疊水凝膠，以概括在人體中空或管狀器官中觀察到的黏膜摺疊形態。
參考文獻：
doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120216
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