本試劑盒僅供體外研究使用!
預期應用
ELISA法定量測定小鼠血清、血漿或其它相關生物液體中TG含量。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，製成固相載體，往包被抗 TG抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗 TG抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌後用底物 TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 TG呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度( OD值)，計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配製
1. 酶聯板：一塊(96孔)
2. 標準品(凍幹品)： 2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後靜置10分鐘以上，然後反覆顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20 nmol/ml，做系列倍比稀釋(註：不要直接在板中進行倍比稀釋)後，分別稀釋成20 nmol/ml，10 nmol/ml，5 nmol/ml，2.5 nmol/ml，1.25 nmol/ml，0.625 nmol/ml，0.312 nmol/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 nmol/ml，臨用前15分鐘內配製。如配製10 nmol/ml標準品：取0.5ml (不要少於0.5ml ) 20 nmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml。
6. 檢測溶液A：1×120μl(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製(100μl/孔)，實際配製時應多配製 0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內配製。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
11. 覆膜：5張
12. 使用說明書：1份
自備物品
1. 酶標儀(建議參考儀器使用說明提前預熱)
2. 微量加液器及吸頭，EP管
3. 蒸餾水或去離子水，全新濾紙
標本的採集及保存
1. 血清：全血標本請於室溫放置2小時或4℃過夜後於1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本採集後30分鐘內於2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
3. 其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
4. 樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋100倍，如：稀釋100倍，取10uL血清或血漿加入990uL樣品稀釋液。標本使用0.1 M 的PBS稀釋(PH=7.0-7.2)。
註：以上標本置4℃保存應小於1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過1個月，-80℃不應超過2個月；標本溶血會影響最後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解)；試 劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時儘量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋後的樣品符合試劑盒的檢測範圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100μl，餘孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩幹，不用洗滌。每孔加 檢測溶液A工作液 100μl(在使用前一小時內配製)，酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。
3. 溫育60分鐘後，棄去孔內液體，甩幹，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩幹(也可輕拍將孔內液體拍幹)。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
5. 溫育60分鐘後，棄去孔內液體，甩幹，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩幹(也可輕拍將孔內液體拍幹)。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，後3-4孔梯度不明顯，即可終止)。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應儘量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到後應儘快加入終止液。
8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液後立即進行檢測。
註：
1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用後請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉汙染。
2. 加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，第一個孔與最後一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 「預孵育」時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重複性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)最好控制在 10分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3. 孵育：為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於鋪有溼布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板後應儘快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處於乾燥狀態;同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍幹，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最後的酶 標儀讀數。
5. 試劑配製：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，並使用相應的稀釋液配製，不能混淆。請精確配置標準品及工作液，儘量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小於10μl)，以避免由於不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重複使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6. 反應時間的控制：加入底物後請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請最後乘以稀釋倍數。
洗板方法
1. 手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩衝液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重複此過程數次。
2. 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠TG，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為縱坐標(對數坐標)， OD值為橫坐標(對數坐標)，在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業製作曲線軟體進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
檢測範圍：0.312 nmol/ml - 20 nmol/ml
最低檢測限：0.078 nmol/ml
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和汙染，試劑避免受到微生物的汙染，因為蛋白水解酶的幹擾將導致出現錯誤的結果。
2. 小心吸取試劑並嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，第一個孔與最後一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 「預孵育」時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重複性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存於-20℃，部分試劑保存於2-8℃，具體以標籤上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期：6個月