小鼠高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供體外研究使用
預期應用
ELISA法定量測定小鼠血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生物液體中高密度脂蛋白(HDL)含量。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，製成固相載體，往包被抗HDL抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗HDL抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HDL呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配製
1. 酶聯板：一塊（96孔）
1. 標準品（凍幹品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後靜置10分鐘以上，然後反覆顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5 mmol/L，做系列倍比稀釋(註：不要直接在板中進行倍比稀釋)後，分別稀釋5 mmol/L，2.5 mmol/L，1.25 mmol/L，0.625 mmol/L，0.312 mmol/L，0.156 mmol/L，0.078 mmol/L，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 mmol/L，臨用前15分鐘內配製。
如配製2.5 mmol/L標準品：取0.5ml（不要少於0.5ml）5 mmol/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘濃度以此類推。
2. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
3. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
4. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
5. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100ul），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內配製。
6. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
7. 底物溶液：1×10ml/瓶。
8. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
9. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
10. 覆膜：1×5張
標本的採集及保存
1. 血清：全血標本請於室溫放置2小時或4℃過夜後於1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本採集後30分鐘內於2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
3. 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
註：以上標本置4℃保存應小於1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月；標本溶血會影響最後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測。
操作步驟
實驗開始前，請提前配製好所有試劑；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時儘量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，均應用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測範圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立最佳稀釋倍數。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，餘孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩幹，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內配製），37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘後，棄去孔內液體，甩幹，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩幹（也可輕拍將孔內液體拍幹）。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。
5. 溫育60分鐘後，棄去孔內液體，甩幹，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩幹（也可輕拍將孔內液體拍幹）。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，後3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應儘量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到後應儘快加入終止液。
8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液後立即進行檢測。
注：
1. 每次實驗留一孔作為空白調零孔（不同於空白孔），該孔不加任何試劑，只是最後加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用後立即冷藏保存試劑。
3. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保儘量吸乾孔內液體。為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於鋪有溼布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發；洗板後應儘快進行下步操作，避免酶標板長時間處於乾燥狀態。
4. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
5. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
6. 未使用完的酶標板或者試劑，請於2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，請精確配置標準品及工作液，儘量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小於10ul），以避免由於不準確稀釋而造成的濃度誤差；檢測液A、B，以及底物溶液在使用前，應置於37℃溫育30分鐘；請勿重複使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
7. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩衝液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需
要，重複此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠高密度脂蛋白(HDL)，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業製作曲線軟體進行分析，如curve expert 1.3），根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。
4. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請最後乘以稀釋倍數。
5. 在配製標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配製，不能混淆。
6. 底物請避光保存。
7.
檢測範圍：0.078 mmol/L - 5 mmol/L
最低檢測限：0.02 mmol/L
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和汙染，試劑避免受到微生物的汙染，因為蛋白水解酶的幹擾將導致出現錯誤的結果。
2. 小心吸取試劑並嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，第一個孔與最後一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 「預孵育」時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重複性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。
3. 試劑盒保存：短期（2周以內）以標籤上的標示為準，長期保存請將試劑全部保存於-20℃。
4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期：6個月