人金屬硫蛋白（MT）ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
檢測範圍：7.8 ng/ml -500 ng/ml
最低檢測限：1.95 ng/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人MT，且與其他相關蛋白無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中MT含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
概述
1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學作用時，從動物器官分離出一種新的蛋白質，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質稱為金屬硫蛋白（Metallothionein， MT）。人體內、動物、植物以及微生物均含MT，而且其理化特性基本一致。MT分子呈橢圓形，分子量為6500Da，含有兩個結構域，每個分子含7-12個金屬原子，具有特殊的光吸收。MT構象較堅固，具有較強的耐熱性。由於MT分子中含有20個游離的巰基（-SH）基因以及由它們組成的多個巰基簇，從而使它生物體中同時具有六大功能：清除體內自由基、防止基體衰老；解除重金屬的毒性；參與體內微量元素的代謝；增強機體對各種不良狀態的適應能力；鋅元素的貯存庫以及防止細胞癌變。自從MT被發現以來，它已成為基礎科學研究的熱點之一。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，製成固相載體，往包被抗MT抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗MT抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MT呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配製
1. 酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：2瓶（凍幹品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恆溫培養箱
4. 乾淨的試管和Eppendof管
5. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的採集及保存
1. 血清：全血標本請於室溫放置2小時或4℃過夜後於1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本採集後30分鐘內於2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
3. 細胞培養物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放於-20℃或-80℃保存，但應避免反覆凍融。
註：標本溶血會影響最後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的範圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最後計算濃度時，稀釋了「N」倍，標本的濃度應再乘以「N」。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後靜置10分鐘以上，然後反覆顛倒/搓動以助溶解，其濃度為500 ng/ml，做系列倍比稀釋後，分別稀釋500 ng/ml， 250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配製。
如配製250 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少於0.5ml）500 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100μl），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內配製。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100μl），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內配製。
操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時儘量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測範圍。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，餘孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩幹，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內配製），37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘後，棄去孔內液體，甩幹，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩幹。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
5. 溫育60分鐘後，棄去孔內液體，甩幹，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩幹。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，後3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應儘量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到後應儘快加入終止液。
8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液後15分鐘以內進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最後加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於鋪有溼布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請於2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重複使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩衝液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重複此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應儘量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請最後乘以稀釋倍數。
6. 在配製標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配製，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。