教你撩5分傻白甜~

原標題：教你撩5分傻白甜~

3月資源包：關注 "解螺旋" 微信公眾號，回復關鍵詞"3月"可索取DNA序列分析軟體。

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作者：Lucky King（本文為讀者來稿，轉載請註：解螺旋·醫生科研助手）

這一期本打算講解一篇Nature上30多分的paper，後來想想此等白富美也只有高富帥（大牛導師、好的實驗室、經費充足、自身聰明上進）才好撩到。So，4.652的傻白甜學習下，小大夫&小青椒們一年撩兩篇也足夠了。

本文題目是：LPS刺激誘導結腸癌細胞模型中，通過增加NF-κB與VEGDR-3啟動子結合的機制，上調VEGDR-3表達進而促進細胞的遷移與侵襲（回復「0328」可下載文獻）。

一、實驗假說

通過免疫組化觀察結腸癌患者臨床樣本VEGFR-3表達，在癌旁組織和正常大腸黏膜細胞中，VEGFR-3不表達或者表達量很低（Fig.1 A）； 在大腸癌組織中VEGFR-3的表達呈陽性或高（Fig.1 B）。因此，VEGFR-3的表達可能促進結腸癌的發展。

二、結果解讀

表2臨床數據結直腸癌組織和正常結腸直腸組織中的VEGFR-3表達情況。* P <0.05

表2

Fig.1

建立體外細胞模型：用LPS（脂多糖）刺激sw480和HCT116兩種結腸細胞系，通過q PCR和WB檢測VEGFR-3的mRNA和蛋白表達量。

Fig.2 A&B：sw480和HCT116細胞中VEGFR-3的mRNA和蛋白表達水平量近似；

Fig.2 C&D：LPS刺激sw480細胞中VEGFR-3 mRNA和蛋白表達，且隨LPS劑量增加；

Fig.2 E& F：LPS刺激HCT116細胞中VEGFR-3 mRNA和蛋白表達水平，且隨LPS劑量增加；

兩個結腸癌細胞模型成功建立。

Fig.2

在LPS誘導的細胞模型中，VEGFR-3在促進細胞的遷移和侵襲過程中具有非常重要的作用Fig.3（A-D）Cell proliferation assay，LPS處理sw480和HCT116，不影響細胞增殖；使用Transwell法檢測LPS誘導細胞模型sw480和HCT116的遷移和侵襲能力：Fig.3（E&F）模型組（LPS刺激）細胞遷移與侵襲總數明顯高於正常組（無LPS）；在模型組中添加VEGFR-3抗體IgG（LPS-800ng-IgG），阻斷其生物活性，細胞遷移與侵襲總數顯著下降。表明VEGFR-3參與細胞遷移與侵襲的過程。

Fig.3

Fig.4(A) 蛋白質印跡實驗表明模型組中LPS受體TLR4蛋白表達；

Fig.4(B) 與正常組對比，模型組NF-κB表達水平沒有明顯差異；p-NF-κB表達明顯升高。

LPS通過TLR4受體激活NF-κB。

Fig.4

構建VEGFR-3基因啟動子5'端部分缺失的一系列載體，轉染到細胞系中。

Fig.5 (A)將包含不同VEGFR-3啟動子片段質粒轉染細胞pGL3B-1659…..pGL3B-59和pGL3-Basic(無啟動子、對照) ，質粒為腎素螢光素酶表達載體pRL-TK。pGL3B-1659、pGL3B-1159、pGL3B-834、pGL3B-609、pGL3B-334、和pGL3B-159組螢光強度顯著高於pGL3B-59和pGL3B-Basic。pGL3B-159相對於pGL3B-1659（全長啟動子）具有高螢光素酶活性，表明-159鹼基至+65鹼基區域是VEGFR-3啟動子具有活性的重要區域。選擇質粒pGL3B-159用於下一步研究。pGL3B-59質粒轉染細胞中的螢光素酶活性遠低於pGL3B-159，表明VEGFR-3啟動子中該區域（-159nt至-59nt）有重要作用。作者使用生物信息學軟體搜索，認為該區域可能是轉錄因子結合位點。

Fig.5（B）VEGFR-3啟動子部分核苷酸序列，-137鹼基到-128鹼基是NF-κB結合位點在 。

Fig.5（C）將VEGFR-3啟動子序列中NF-κB結合位點進行突變，構建pGL3B-159-mut質粒。pGL3B-159-mut與對照未突變質粒pGL3B-159相比，結合位點的突變導致VEGFR-3啟動子活性降低約40％。表明NF-κB結合位點對pGL3B-159質粒的活性非常重要。

Fig.5（D&E）LPS處理，pGL3B-159質粒活性顯著增加，並且具有濃度依賴性。

Fig.5

為了驗證NF-κB在VEGFR-3啟動子活性中作用，構建超表達載體PcDNA3.0-NF-κB和基因沉默載體siRNA-NF-κB。PcDNA3.0-NF-κB超表達組，NF-κB表達量顯著增加Fig.6(A)；siRNA-NF-κB組，NF-κB表達量顯著降低Fig.6(C)。

將pGL3B-159質粒分別與PcDNA3.0-NF-κB質粒、siRNA-NF-κB質粒共轉染sw480細胞，檢驗螢光強度：NF-κB超表達組（PcDNA3.0-NF-κB）螢光強度顯著高於對照，NF-κB的過表達增加VEGFR-3啟動子的活性 Fig.6(B)；小RNA幹擾組（siRNA-NF-κB）螢光強度強度顯著降低，降低VEGFR-3啟動子活性Fig.6(D)。

將過表達質粒（pcDNA3.0-NF-κB）分別與pGL3B-159、pGL3B-159-mut（NF-κB結合位點突變）共轉染sw480細胞。隨著pcDNA3.0-NF-κB 濃度的增加，pGL3B-159組螢光增強並表現出劑量依賴性Fig.6(E)，而pGL3B-159-mut組沒有Fig.6(F)。結果表明，VEGFR-3啟動子活性與NF-κB有關，並具有濃度依賴性。

Fig.6

通過EMSA（凝膠遷移實驗）進一步驗證LPS影響NF-κB的表達。用生物素標記的NF-κB DNA序列探針，檢驗細胞核提取物中NF-κB表達含量。用LPS-800ng/ml處理的sw480細胞核提取物中NF-κB含量最高（紅色箭頭處）Fig.7(A)。

為了確定NF-κB是否與VEGFR-3啟動子結合，作者進行了染色質免疫共沉澱實驗。問度娘要了ChIP的原理圖，結合本文進行了注釋：

如Fig.7(B)所示，NF-κB與VEGFR-3啟動子結合，受LPS刺激可增強二者結合。

Fig.7

簡單說下ChIP實驗分組：

1、input組：樣本經過超聲，不進行ChIP，提取總DNA。

2、陰性對照：用普通的IgG做為抗體，不會ChIP任何DNA片段。

3、實驗組。

所用PCR引物相同，本實驗中就是按照VEGFR-3啟動子序列涉及的引物。

擴增後凝膠電泳。

三、套路分析

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