RapiGest SF試劑:促進溶液中蛋白酶解的有利工具

Ying Qing Yu與Martin Gilar
美國麻薩諸塞州米爾福德沃特世公司

簡介
本應用紀要中，我們介紹了沃特世專利RapiGest™ SF試劑的物理化學性質及其應用領域。2002年，我們首次推出RapiGest SF，這一創新產品是幫助酶消解的有利工具，可促進溶液中蛋白的消解，它能夠改善樣品製備過程中蛋白的溶解度。
RapiGest SF提高酶解速率與完全程度的機理詳見圖1。溫和的蛋白變性可打開蛋白結構並暴露酶切位點，以供酶切。在RapiGest SF溶液中，酶對變性的耐受性優於普通蛋白，並能保持活性。在加入酶之前高溫加熱RapiGest SF溶液可使球蛋白更為完全變性，之後需將酶與樣品一起進行37 °C的孵育。

圖1 蛋白底物在RapiGest SF溶液中變性􀉼之後對蛋白酶切更為敏感

超過200多家行業內雜誌引用了使用RapiGest SF進行樣品溶解的案例，大部分為蛋白組學的應用。最近，許多製藥實驗室使用RapiGest SF用於蛋白藥物的確證。因為酶消化的速度的提高並在LC、MS分析前極易清除，RapiGest SF已被多個應用領域廣泛接受，其中包括高級序列研究的LC/UV/MS蛋白藥物的肽圖分析。

討論
什麼是RapiGest SF?
RapiGest SF是酸性不穩定表面活性劑，在酸性條件下極易水解。1這種獨特的性質，在需要的時候，可用於從溶液中清除表面活性劑。RapiGest SF的結構及其水解副產物見圖2。酸性不穩定的性質可在pH2條件下，45分鐘內達到完全降解。

 

該表面活性劑可降解為兩個產物：dodeca-2-one和3-（2,3-二羥基丙基）丙磺酸鈉。前者與水不能互溶，可通過離心清除。後者在水溶液中溶解度很高，而在反相LC模式下不保留。酶消解後的水溶液可直接進行HPLC、LC/MS或MALDI-TOF MS進行分析。

消解後的清除
樣品分析前無需額外去清除表面活性劑（如透析）。在分析前，酶消解後通常經過酸（如甲酸、三氟乙酸（TFA）或鹽酸（HCl））的酸化，降解RapiGest SF。建議降解條件pH ≤ 2。

胰蛋白酶消解的兼容性
胰蛋白酶是最常見的蛋白水解酶，可用於肽圖分析和蛋白組學的應用。我們研究了在添加RapiGest SF的情況下胰蛋白酶的活性作用，並與文獻中最常見的變性劑的作用做了對比。本檢測基於胰蛋白酶誘導N-α-苯甲醯-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）在50 mM重碳酸胺（pH 7.9）中的室溫水解。胰蛋白酶活性的變化通過UV 253 nm下測量BAEE水解率進行計算。在選擇的變性溶液中，胰蛋白酶活性與對照樣品進行對比（非變性劑）。結果見於表1。 

 表1中的數據說明低濃度下（0.1%） RapiGest SF不抑制胰蛋白酶的活性。這與結構上類似的表面活性劑SDS不同，SDS是很強的變性劑，可會使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或鹽酸胍也是胰蛋白酶消化的變性劑。但是乙腈是強洗脫劑會干擾消解樣品進行反相LC分析。正如我們所知，尿素可使蛋白共價修飾，鹽酸胍也和SDS一樣可以使酶失活。
本實驗說明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用變性劑的影響。RapiGest SF在從低到高的濃度下均不改變酶活性，因此，最佳的蛋白消解條件是無需過量酶即可達到酶解的結果。

快速蛋白消解
對蛋白酶解存在抗性的蛋白使用RapiGest SF試劑，可在數分鐘內消解完全。完全消解球蛋白、馬肌紅蛋白只需要5分鐘內即可完成。該試劑輔助的消解結果與對照見圖3。由於肌紅蛋白是球蛋白，眾所周知，若沒有表面活性劑將難以消解。在對照反應中，與胰蛋白酶孵育9小時後只有少量的蛋白可以消化。使用了RapiGest SF試劑，總體的消解的效率顯著提升。

在蛋白藥物肽圖中的序列覆蓋範圍更大
RapiGest SF在蛋白組學的樣品前處理中廣泛使用，是有效的蛋白溶解變性劑。最近越來越多的生物製藥實驗室在肽圖分析中採用了RapiGest SF。一些發表的論文記錄了使用RapiGest SF進行蛋白藥物消解的優勢。4,5經報導的RapiGest SF濃度範圍為0.05 -1%，取決於蛋白疏水性與濃度。
我們發現濃度範圍為0.05 -1%的RapiGest SF足以使各種大小的蛋白變性，高濃度RapiGest SF適合全細胞蛋白提取的實驗。
單抗（mAbs）肽圖分析一直以來都因為難以消解這些大疏水蛋白而難以實現。肽圖分析的目的是確認蛋白序列並發現所有存在後翻譯修飾（PTMs）的蛋白。圖4舉例說明了RapiGest SF輔助的人單抗消解的實例。樣品製備與分析的參數以UPLC®和四級杆Tof質譜分析的參數已列表作為指導。
圖4顯示實驗中總序列覆蓋率為98%。數據分析通過BiopharmaLynx™ v.1.2軟體得到。高序列覆蓋率（98%）說明單抗完全消解。LC/MS分析中沒有發現錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的2%未確認的序列為少數二個胺基酸的肽或單個胺基酸（R或K），而無法在反相柱上保留。

樣品製備
人單抗樣品（10 μL, 21 mg/mL）在含有0.1% （w/v） RapiGest SF 的50 μL 50 mM重碳酸銨中溶解。將2 μL 0.1 M的二流蘇糖醇（DTT）加入樣品，樣品在50 °C加熱30分鐘，加入4 μL 0.1 M的碘代乙醯胺，在樣品冷卻至室溫後樣品在黑暗中靜至40分鐘。 

 
樣品中加入8 μg胰蛋白酶（胰蛋白酶濃度= 1 μg/μL），樣品在37 °C孵育過夜。消解樣品與1%甲酸與10%乙腈混合（1：1，v：v）。用Milli-Q水（Millipore）稀釋至5 pmol/μL後進行LC/MS分析。

LC 條件 
    

LC 系統	沃特世 ACQUITY UPLC®系統
色譜柱	ACQUITY UPLC BEH 300 C18 肽分離專用柱, 2.1 x 100mm （P/N = 186003686）
柱溫	40 °C
樣品進樣	2 μL （10 pmol）
溶液A	0.1% 甲酸水溶液
溶液B	0.1% 甲酸乙腈溶液
流速	200 μL/min
梯度	0-2分鐘:2%B
	2 – 92分鐘：2 -35% B
	92 -102分鐘：35 - 50% B
	102.1 -105 分鐘：90% B
	105.1-110分鐘：2% B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MS條件

MS系統	沃特世SYNAPT™ MS （V型）
毛細管電壓	3.2 kV
源溫度	120 °C
去溶劑溫度	350 °C
去溶劑氣	700 L/hr
MS 掃描速率	1 秒/次
鎖定質量通道	100 fmol/μL Glu-Fib多肽（m/z 785.8426, z = 2），流速20 μL/min

 

 

 

 

 

 

與其他的蛋白酶合用
我們測試了RapiGest SF與多種蛋白酶的適配性，如Asp-N, Lys-C與Glu-C。在酶解前使用RapiGest SF變性蛋白獲得了有效的消解結果。 

蛋白去糖基化的用途
RapiGest SF也用於測試其它酶，如PNGase F，該酶用於酶切糖蛋白N-連接的糖基。2圖6說明了去糖基化雞蛋卵清蛋白。在RapiGest SF介質中PNGase F消解2小時後觀察到了完全的去糖基化反應。 

結論
? RapiGest SF促進了蛋白酶解的速度與完全程度，能夠得到蛋白藥物序列覆蓋率很高的肽圖分析。
? RapiGest SF是適用於蛋白組學、糖蛋白與生物製藥應用的領域
? 幾乎無需消解後樣品處理，簡單樣品酸化，足以從溶液中去除RapiGest SF。多種情況下LC/MS分析前只需簡單稀釋。
? RapiGest SF簡化了樣品製備方法，可提高分析通量；使用該方法提高實驗室工作效率並提高數據質量。

參考文獻
1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003; 75: 6023-6028.

2. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC, A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun.Mass Spectrom. 2004; 18: 711-715.

3. Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometry characterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 2331-2336.

4. Bailey MJ, Hooker AD, Adams CS, Zhang S, James DC. A platform for high- throughtput molecular characterization of recombinant monoclonal antibodies, J. Chrom. B. 2005; 826: 177-187.

5. Huang HZ, Nichols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009; 81 (4): 1686-1692.