中國科學院化學研究所汪銘課題組JACS:酶指導的激活體內前蛋白療法

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導讀

近日，中國科學院化學研究所汪銘研究員課題組報導了一種簡單而通用的化學方法來設計前蛋白療法(PPT)，通過調節蛋白活性來響應疾病細胞的內源性酶，以及其靶向癌症治療的潛力，證明了在NQO1存在的情況下，一種可被腫瘤細胞特異性NAD(P)H脫氫酶(NQO1)還原的配體(GPN)對蛋白質的化學修飾是可逆的。重要的是，GPN修飾的細胞色素c (Cyt c-GPN)和核糖核酸酶A (RNase A-GPN)具有NQO1調控的高選擇性蛋白活性。此外，利用一種新型的脂質納米顆粒在細胞內傳遞RNase A-GPN，並隨後通過細胞NQO1激活蛋白，可以在體外選擇性抑制癌細胞生長，在體內有效抑制腫瘤生長。該研究成果在JACS上發表。（DOI:10.1021/jacs.9b08669）

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NAD(P)H脫氫酶(NQO1)是一種胞質黃素酶，可以催化醌類化合物的減少以保護細胞免受氧化應激，大量研究發現其在癌細胞中過表達。近年來，利用過表達NQO1的腫瘤細胞激活小分子前藥，有效提高了其治療效果。因此作者設計了一種含有醌丙酸(GPN)的化學配體來修飾蛋白賴氨酸，形成醌和蛋白偶聯物。GPN修飾和NQO1催化的GPN去除策略可適用於不同大小的蛋白，包括綠色螢光蛋白(GFP)、細胞色素c (Cyt c)和核糖核酸酶A (RNase A)。此外，GPN修飾Cyt c或RNase A，以及NQO1觸發的GPN去除，有效控制了蛋白活性。

圖1. NQO1催化的蛋白質的化學修飾及其在細胞內的傳遞路徑，以激活活細胞中的蛋白質，實現潛在的靶向癌症治療。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者合成了可與NQO1反應的配體GPN和不含可與NQO1反應部分的對照配體(PN)。首先在0.1 M NaHCO3溶液(pH 9.5)中以1:300的摩爾比將GFP與GPN或PN混合，然後反應6 h，離心純化，使每個GFP分子平均與7個GPN或PN分子偶聯。然而，用NQO1處理GFP-GPN或GFP-PN時，蛋白質的去甲基化結果有很大不同。GFP-GPN(50 μg /mL)與NQO1 (100 ng/mL)孵化可以使GPN有效從蛋白質上去除，而當GFP-PN同樣與NQO1孵化時沒有觀察到PN被去除，說明GPN修飾可以使NQO1特異性去除蛋白質軛合物。

圖2. NQO1處理前後GFP-GPN (a)和GFP-PN (b)的MALDI-TOF（基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜分析）質譜表徵。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來，作者研究了Cyt c和RNase A的GPN修飾，以進一步證明該方法在開發NQO1響應蛋白偶聯物和利用NQO1控制蛋白活性方面的普遍性。MALDI-TOF分析表明，GPN與上述蛋白混合後，GPN能有效修飾Cyt c和RNase A。通過對RNase A-GPN或RNase A-PN的蛋白水解消化和質譜分析，詳細研究了RNase A的修飾位點，發現GPN和PN偶聯導致多個賴氨酸殘基的修飾，這些修飾降低了蛋白活性。此外，RNase A的GPN或PN修飾對蛋白質構象的影響很小。重要的是，當Cyt c-GPN或RNase A-GPN被NQO1處理時，GPN配體被有效去除。而使用NQO1處理Cyt c-PN或RNase A-PN時均未觀察到配體被去除。酶活性測定結果表明，GPN修飾Cyt c或RNase A的賴氨酸明顯降低了其活性，而NQO1處理有效恢復了蛋白活性。經修飾的Cyt c- GPN和Cyt c-PN的酶活性降低到約5%。然而，與未和NQO1孵育相比，使用NQO1處理可使Cyt c-GPN活性增加20倍。此外，在NQO1處理下未觀察到Cyt c-PN活化。且當兩種蛋白都被NQO1處理時，RNase A-GPN表現出NQO1調節的蛋白活性，但是RNase A-PN沒有。此外，當Cyt c-GPN或RNase a - GPN在競爭性NQO1抑制劑(如雙香豆素)存在的情況下使用NQO1處理時，蛋白激活被顯著抑制。

圖3.在有無NQO1抑制劑(雙香豆素)的情況下，用NQO1處理Cyt c-GPN (a)或RNaseA- GPN (b)的酶活性測定。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

RNase A可以催化細胞內RNA的水解，促進細胞內RNA的死亡。然而，腫瘤細胞特異性NQO1對RNase A-GPN活性的控制由於蛋白進入細胞的低效率而被大大阻礙。因此，將蛋白偶聯物導入腫瘤細胞以激活NQO1並進行靶向治療至關重要。作者合成了一個陽離子脂質庫，並通過自組裝蛋白質脂質納米顆粒篩選了有效的蛋白質遞送載體。最近，作者證明了將活性氧(ROS)可分裂的硫代乙二胺基轉移到脂質納米顆粒中可以促進細胞內脂質降解和癌細胞內蛋白釋放，從而增強基因沉默。作者假設這種ROS增強的遞送策略同樣適用於遞送RNase A-GPN以促進癌細胞內蛋白的釋放，使NQO1催化的RNase A-GPN激活。因此作者利用脂質納米顆粒和RNase A-GPN組成的自組裝納米複合物處理過表達NQO1的HeLa細胞，研究這些脂質傳遞RNase A-GPN的能力。RNase A-GPN的高效遞送及胞內NQO1的激活可抑制腫瘤細胞的生長，因此作者測量了脂質/RNase A-GPN納米顆粒處理後HeLa細胞的活力，以比較不同脂質處理的蛋白遞送效率。

圖4. RNase A-QPN的脂質納米顆粒有效遞送的鑑定。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了進一步驗證細胞內NQO1在激活RNase A-GPN中的關鍵作用，作者首先利用RNA幹擾(RNAi)在ROS-TK-12/RNase A-GPN遞送前敲除HeLa細胞內的NQO1。細胞內NQO1水平的定量和比較結果顯示，與未處理的細胞相比，siNQO1處理(80 nM siRNA)使HeLa細胞中NQO1的表達降低了40%。此外，與未處理的細胞相比，siNQO1處理使HeLa細胞中的NQO1活性降低了55%，而阻止siRNA的傳遞並沒有導致NQO1表達下調。siNQO1轉染的HeLa細胞用ROS-TK-12 /RNase A-GPN納米顆粒進一步處理。結果表明，與未轉染siNQO1的HeLa細胞相比，轉染siNQO1的HeLa細胞對ROS-TK-12/RNase a - GPN的細胞毒性明顯降低。由於上述發現，作者進一步研究了NQO1刺激因子蘿蔔硫素的存在是否能刺激NQO1低表達細胞系HEK293T中RNase a - GPN的激活。結果證明蘿蔔硫素(1.33 μM)處理HEK293T細胞後細胞內NQO1水平是沒有蘿蔔硫素刺激的細胞的1.6倍。用ROS-TK-12 /RNase A-GPN納米顆粒處理對HEK293T細胞的細胞毒性很小，因為這些細胞中的低NQO1水平有效阻止了RNase A-GPN激活。然而，將ROS-TK-12/ RNase A-GPN轉染到蘿蔔硫素預處理的HEK293T細胞後，細胞存活率比未處理的細胞降低了25%。

圖5.RNA幹擾(a)或蘿蔔硫素刺激HEK293細胞NQO1表達下調(b)有效調控了RNase A-GPN的激活，從而調控了ROS-TK-12/RNase A-GPN納米顆粒的對細胞的毒性。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

最後，作者研究了ROS-TK-12/RNase A-GPN納米粒子的體內遞送，以證明其抗腫瘤作用。作者在BALB/c雌性小鼠左側腋窩皮下注射HeLa細胞，建立了HeLa宮頸癌異種移植瘤模型，再向HeLa荷瘤小鼠體內注射了螢光標記的ROS-TK-12/FITC-RNase AGPN納米顆粒，對小鼠器官進行螢光成像。給藥6小時後，ROS-TK-12/ FITC-RNase A-GPN納米顆粒在腫瘤部位有效積累。相比之下，FITC-RNase A-GPN注射並未導致任何腫瘤靶向的蛋白遞送。作者又在HeLa腫瘤模型中比較了ROS-TK-12/RNase a - GPN納米顆粒對腫瘤生長的抑制作用，將ROS-TK-12/RNase A-GPN納米顆粒靜脈注射到荷瘤小鼠體內，同時以游離RNase AGPN或ROS-TK-12納米顆粒作為陰性對照。結果顯示，與用磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)處理小鼠相比，游離RNase A-GPN或ROS-TK-12注射對腫瘤生長的抑制作用最小。與此形成鮮明對比的是，以每2天一次的頻率給藥5次ROS-TK-12/RNase A-GPN納米顆粒(2.5 mg/kg)，可抑制腫瘤生長達80%。且與PBS注射相比，ROS-TK-12/RNase A-GPN納米顆粒治療小鼠的體重變化可以忽略不計，也就說明該方法具有很高的生物相容性，可用於安全有效的癌症治療。

圖6.ROS-TK-12/RNase A-GPN納米粒的體內分布以及不同納米顆粒處理HeLa荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結：中國科學院化學研究所汪銘課題組報導了一種簡便和通用的化學方法來修飾蛋白，並選擇性地控制NQO1高表達腫瘤細胞中的蛋白活性。通過使用響應ROS的脂質納米顆粒遞送蛋白，證明了NQO1誘導PPT激活對癌症靶向治療的效力。RNase A-GPN的胞內傳遞及其隨後被NQO1激活，有效地抑制了腫瘤細胞的生長。該方法增加了潛在有用的化學工具的數量，使用疾病細胞特異性酶可逆地控制蛋白質的結構和功能，為動態生物學過程的研究和精確的蛋白質治療的發展提供了機會。

撰稿人：馮虹

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