柴繼傑課題組與合作者首次揭示植物TNL類抗病蛋白激活的分子機制

植物先天免疫是植物在與病原微生物長期共同進化的過程中逐漸形成的免疫對抗機制，用來抵抗病原微生物的侵害。其中一類重要組成部分是效應蛋白引起的先天免疫（Effector-Triggered Immunity, ETI）。NLR（Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing receptor）是調節ETI的一類主要受體蛋白。根據其N端結構域，NLR主要分為兩類：CNL (CC-NB-LRR) 和TNL (TIR-NB-LRR)【1】。這兩類受體蛋白都可以直接或者間接地識別病原菌效應蛋白進而引起ETI【2】。柴繼傑實驗室去年的研究成果表明，來自擬南芥的CNL抗病蛋白ZAR1，識別效應蛋白後可以形成抗病小體 (Resistosome) (點擊查看：Science背靠背 | 柴繼傑/周儉民/王宏偉合作團隊首次發現植物抗病小體)。ZAR1抗病小體可能作為離子通道或者轉運通道引起ETI【3,4】，相比CNL，TNL的作用機制更為複雜。TNL的N端TIR結構域具有NAD＋水解酶活性（NADase）。該活性被認為用以產生第二信使信號，激活下遊的EDS1、NRG1等免疫通路【5-7】。目前還有很多TNL信號傳導相關問題有待回答。例如TNL如何識別效應蛋白？TNL是否可以形成抗病小體？識別效應蛋白對TIR的NAD＋水解活性是否有調節作用？

之前的研究發現，擬南芥的RPP1是TNL類抗病蛋白的典型代表，主要由N端TIR結構域、中間NOD (Nucleotide binding oligomerization domain) 結構域以及C端亮氨酸重複 (Leucine rich repeat, LRR) 結構域組成。植物葉片在被植物病原菌Hyaloperonospora arabidopsis侵染過程中會分泌一類效應蛋白ATR1，RPP1通過識別ATR1繼而引起ETI【8】。

2020年12月4日，清華大學生命學院柴繼傑課題組和德國馬克斯-普朗克植物育種研究所Jane Parker課題組、Paul Schulze-Lefert課題組合作在Science 發表了題為Direct pathogen-induced assembly of an NLR immune receptor complex to form a holoenzyme 的研究論文，首次揭示了植物TNL類抗病蛋白RPP1直接識別其效應蛋白ATR1後激活並形成全酶的分子機制。此外，Science同期還配發了題為Enzyme formation by immune receptors的評論文章。

RPP1抗病小體結構的解析

該研究利用杆狀病毒表達系統在昆蟲（Spodoptera frugiperda）細胞裡重組共表達了TNL類抗病蛋白RPP1與其效應蛋白ATR1，通過串聯純化的方法得到了高純度的激活狀態RPP1-ATR1複合物，命名為RPP1抗病小體（RPP1 resistosome）。通過冷凍電鏡單顆粒重構技術，成功解析了RPP1結合ATR1形成四聚體激活狀態的冷凍電鏡結構，解析度為3.16 （圖1），並結合遺傳學和生物化學的手段進一步闡釋了它發揮功能的具體機制。

圖1 RPP1抗病小體四聚體結構

新結構域C-JID電鏡結構的發現

電鏡結構顯示RPP1的LRR結構域直接參與ATR1的結合。除此之外，結構比較發現RPP1的C末端有一個新的結構域C-JID（C-terminal jell roll and Ig-like domain）也直接參與ATR1的直接識別。進一步分析表明，C-JID幾乎存在於所有的TNL中，暗示該結構域可能對TNL識別配體具有廣譜作用。RPP1識別ATR1引起自身構象變化，從而解除分子內自抑制，形成四聚體的激活狀態。該結構為NLR直接識別效應蛋白的假說提供了有力證據。

RPP1抗病小體以全酶狀態催化NAD＋水解機制的發現

生化分析表明RPP1抗病小體的形成可以極大地促進NAD＋水解活性，並且二價金屬離子如鎂離子以及鈣離子可以進一步促進該活性。結構分析顯示了RPP1抗病小體作為一個全酶催化NAD＋水解的機制。有別於其它C4對稱性的結構域，抗病小體中的4個TIR結構域採用C2對稱性，即兩個TIR結構域通過類平移對稱形成頭對尾的二聚體，在此基礎上兩個二聚體再通過C2對稱形成四聚體。多方面證據支持RPP1抗病小體中的兩個頭對尾的二聚TIR作為完整的NADase催化NAD＋水解。首先，一個ATP分子結合在一個頭對尾的二聚TIR中；其次，結構比較顯示該ATP分子與TIR的另外一種底物NADP+具有相似的結合位點；最後，BB-loop對於形成頭對尾的TIR二聚體具有重要作用，而突變該loop上的關鍵胺基酸極大降低RPP1抗病小體的NAD＋水解活性以及ATR1誘導的ETI活性。

RPP1抗病小體結合ADP，而非ATP/dATP

關於NLR受體活化，目前一個普遍被接受的觀點是配體結合後促進ATP/dATP交換抑制態中的ADP分子（結合於NOD結構域），從而引起NLR的寡聚化。然而令人吃驚的是，RPP1抗病小體的NOD結構域結合的是ADP，而非ZAR1抗病小體中的ATP/dATP。蛋白質序列分析表明，ZAR1利用CNL高度保守 「TTR」 基序中的R（精氨酸）與ATP/dATP的γ-磷酸基團結合，從而穩定其激活構象。生化以及遺傳數據表明該精氨酸對ZAR1抗病小體功能具有關鍵作用。但是該基序中R在RPP1發生了突變，從而使其失去ATP結合活性。但是這一現象的生物學意義目前尚不清楚，值得將來進一步研究。

綜上所述，該研究首次報導了植物TNL類抗病蛋白RPP1直接識別並結合效應蛋白ATR1、形成抗病小體並作為全酶促進NAD+水解的分子機制。這些結果促進了TNL下遊免疫通路信號傳遞機制的研究，為理解植物TNL類抗病蛋白活化機制提供了範式。

柴繼傑課題組一直致力於NLR家族受體的作用機制。繼此前揭示了CNL類受體ZAR1的自抑制與活化機制後，此次又首次報導了TNL受體RPP1配體識別以及活化的分子機制。作為植物兩大類NLR受體CNL和TNL的代表，ZAR1與RPP1的研究成果是植物抗病蛋白研究領域數十年來一直期待的重大突破。

清華大學生命學院13級博士研究生馬守偲、德國馬克斯-普朗克植物育種研究所博士後Dmitry Lapin、劉莉，清華大學生命學院18級博士研究生孫玥和德國科隆大學博士後宋文為本文的共同第一作者。清華大學生命學院柴繼傑教授、德國馬克斯-普朗克植物育種研究所的Jane Parker教授和Paul Schulze-Lefert教授為本文共同通訊作者。北京結構生物學高精尖創新中心已出站博士後張曉驍，德國馬克斯-普朗克植物育種研究所的Elke Logemann、於東立，德國科隆大學的Jan Jirschitzka，清華大學生命學院助理研究員王家、副研究員韓志富也參與了本項研究。

原文連結：

https://science.sciencemag.org/content/370/6521/eabe3069.abstract

參考文獻

【1】T. Maekawa, T. A. Kufer, P. Schulze-Lefert, NLR functions in plant and animal immune systems: so far and yet so close. Nature immunology 12, 817-826 (2011).

【2】Stuart, L.M., Paquette, N., and Boyer, L. (2013). Effector-triggered versus pattern-triggered immunity: how animals sense pathogens. Nat. Rev. Immunol. 13, 199-206.

【3】J. Wang et al., Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity. Science 364, eaav5870 (2019).

【4】J. Wang et al., Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex. Science 364, eaav5868 (2019).

【5】L. Wan et al., TIR domains of plant immune receptors are NAD(+)-cleaving enzymes that promote cell death. Science 365, 799-803 (2019).

【6】S. Horsefield et al., NAD(+) cleavage activity by animal and plant TIR domains in cell death pathways. Science 365, 793-799 (2019).

【7】D. Lapin et al., A Coevolved EDS1-SAG101-NRG1 Module Mediates Cell Death Signaling by TIR-Domain Immune Receptors. The Plant cell 31, 2430-2455 (2019).

【8】M. A. Botella et al., Three genes of the Arabidopsis RPP1 complex resistance locus recognize distinct Peronospora parasitica avirulence determinants. The Plant cell 10, 1847-1860 (1998).