一、應用小鼠模型研究人病毒感染性疾病的意義與優勢？
2019年12月以來，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）在武漢感染流行並迅速蔓延全國各地，這次事件再次告訴我們，由人致病性病毒引起的感染性疾病，仍然是當前全球公共衛生安全與經濟發展的巨大威脅。世界衛生組織發布的《2007年世界衛生報告》曾指出，自1967年以來，至少有39種新的病毒病原體被發現，包括愛滋病病毒、伊波拉病毒、馬爾堡病毒和SARS病毒。同時，大流感、瘧疾和結核病等傳統疾病不斷產生變種、增加抗藥性，由於人類衛生保健制度發展仍不完善，這些傳統疾病繼續對人類健康構成威脅。因此，不斷努力研究與探索病毒感染性疾病的致病機制，預防病毒感染傳播、研發特異性疫苗與抗病毒藥物的新策略，仍是當前生物醫藥研究領域非常重視與關注的研究領域。
我們知道，應用人群研究病毒感染疾病存在明顯的局限性：1. 遺傳背景多樣性的人群對某些病毒的敏感性差異較大，表現為一些人對某個病毒非常易感，而有些人卻完全不易感，或者只表現非常輕的病症或無症狀。這種反應不一致現象，可被解釋為人體或病毒遺傳特徵上的差異，包括個體健康狀況或人群因素（比如年齡或性別等）。2. 人群過去暴露該病毒的情況，雖然機體已存在針對該病毒的免疫保護作用，但有時候仍然可見相應的免疫病理變化。3. 人群自然感染過程中，有許多影響因素是非常難以控制的，比如病毒感染劑量、過去感染相關病毒史等。4. 倫理方面的限制，很難直接獲取病毒感染病人的相關組織器官，開展致病過程病理機制方面的分析研究。5. 應用人細胞體外簡單培養的系統研究，很難準確模擬體內病毒與宿主之間相互作用的複雜網絡體系。6. 新疫苗與藥物的安全性和有效性評價也不適合直接進行人體試驗。
因此，為了更好地研究病毒感染性疾病中的致病機制，以及有效評價潛在疫苗與治療方法的安全性與有效性，實驗動物模型就成為研究者們必不可少的研究工具。實驗動物模型的優勢在於，不僅可事先設計實驗目的與策略方法，儘可能排除可能干擾實驗結果可靠性的影響因素，比如，病毒感染劑量與疾病形成進程的控制等，而且可實現無法在病人中開展的，但又相當重要及更加具有侵入性（如微創手術等）的實驗操作。
關於病毒與宿主相互作用研究的感染動物模型，雖然可選擇的實驗動物較多，也都具有各自的優勢，然而，目前這方面的研究主要選擇小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂和非人靈長類動物（NHPs)。 在研究人病毒感染性疾病中，小鼠模型優勢是非常明顯的，比如，成本較低、容易繁殖飼養、繁殖較快和產仔數較多。更重要的是，近交系小鼠的遺傳背景具有一致性，在此基礎上，可對小鼠基因進行相應的編輯改造建立需要的模型，這都無疑有助於研究宿主特定基因在病毒致病過程中的影響作用，也有利於深入了解病毒或疫苗引起的宿主免疫系統反應及其免疫保護作用。
當然，小鼠模型也存在局限性。所以，將小鼠模型研究結果轉化為人體時，需要謹慎小心。由於病毒感染人體或小鼠細胞，常常是通過與宿主體內特殊的細胞表面受體結合，與宿主的先天免疫反應等因素有關，而且，小鼠與人之間的存在一定的物種差異性，導致一些人病毒無法直接感染小鼠，或人病毒雖能在小鼠體內複製，但卻難以引起感染疾病明顯的症狀表現。因此，利用各種類型的基因編輯小鼠、人源化小鼠、或者遺傳多樣性的小鼠品系等，從某種程度上可以克服野生型小鼠的短處，使小鼠模型成為研究宿主與病毒致病相互作用，評價疫苗與藥物安全性及有效性的非常有用的研究工具。
小鼠模型在研究人病毒感染性疾病中的應用
二、應用小鼠模型研究人病毒感染性疾病有哪些主要策略與方法？
1. 病毒直接感染近交系小鼠模型
近交系小鼠的優勢在於其實驗操作結果的重複性好，利用C57BL/6或BALB/c 近交系小鼠遺傳背景一致性的特點，降低了小鼠個體間遺傳背景因素可能對病毒感染敏感性差別的影響，從而比較容易研究分析病毒致病及其複製的動態特徵，比較不同病毒株毒力的差異。另外，過去25年以來，近交系C57BL/6小鼠也是基因編輯小鼠模型的常用品系，已被廣泛應用於宿主特定基因在病毒感染應答中作用等方面的研究，為揭示特定基因在病毒感染性疾病或免疫應答中的特殊作用機制發揮了重要的作用。
2. 應用免疫缺陷小鼠模型建立人病毒易感的人源化小鼠模型
由於近交系小鼠對許多病毒不易感，即病毒在近交系小鼠體內不能或低複製，無法引起感染性疾病，比如HIV病毒、肝炎病毒、ZIKV病毒、人諾如病毒、出血熱病毒等。小鼠模型對人病毒不易感，是因為小鼠體內沒有適合人病毒感染的細胞結合受體。應用免疫缺陷小鼠建立人源化小鼠模型的目的，就是通過移植方法，將人細胞/組織導入免疫缺陷小鼠體內，使小鼠含有能與病毒特異結合的受體細胞（人免疫細胞系統）/組織，從而實現人病毒在小鼠體內的複製，並引起病毒感染疾病的發生。
該種人源化小鼠模型是在嚴重聯合免疫缺陷小鼠的基礎之上實現的，目前常用的免疫缺陷小鼠有：NOG（NOD/Shi-scid/IL2 rg null）、NSG（NOD/Scid/IL2 rg null)、NRG(NOD/Rag1null/IL2 rg null) 、BRG（BALB/c-Rag2 null/IL2rg null)和BRGS（BRG-SIRPa variant) 等。此種人源化小鼠模型在許多病毒致病機制（包括HIV、登革熱、流感病毒等）中的研究發揮著重要作用。應用最多的是HIV方面的研究，比如，從該病毒複製、與免疫細胞相互作用，到評估控制與防治HIV感染發生的方法效果等。
除了移植人免疫細胞外，通過移植實體器官（比如肝），免疫缺陷小鼠被也應用於各種肝炎HBV、HCV、HDV和HEV病毒感染等方面的研究。這類研究有助於了解病毒引起肝損傷的病理機制，為評估慢性HCV和HBV感染疾病的潛在治療對策提供了可能。
關於如何利用免疫缺陷小鼠，藉助細胞/組織移植方式，構建人源化病毒感染小鼠模型，研究人相關疾病等方面的策略與技術方法。
3. 應用基因編輯小鼠建立病毒感染性疾病小鼠模型
基因編輯技術的發展與進步，使研究者們通過基因修飾小鼠模型研究病毒感染性疾病成為可能。比如，將病毒感染人細胞相關的基因在小鼠體內表達/敲除/點突變，使原來對這些病毒不敏感的小鼠成為易感宿主，從而在小鼠體內研究病毒致病機製作用等。另外，在研究病毒關鍵蛋白是否參與其感染致病以及抗病毒免疫反應機制等方面，這類基因編輯小鼠模型也發揮了非常重要的作用。
A. 基因敲除病毒感染小鼠模型
針對人病毒感染相關特殊基因，構建基因敲除小鼠模型，將有助於揭示與評價在病毒感染致病過程中，體內參與先天和獲得免疫反應的細胞分子特徵。目前已有一些成功研製的病毒感染相關的基因敲除小鼠模型：1. 參與廣泛免疫反應過程相關基因的敲除，比如，缺乏T細胞α(TCRA)/β（TCR-B） 的基因；缺乏B和T細胞成熟所需的重組激活基因1和2（RAG-1和RAG-2）；導致抗病毒反應受損的IFNs/IFNR的缺乏; 2. 免疫相關受體敲除小鼠模型, 比如，Toll樣受體（TLRs）、維甲酸誘導基因I樣受體（RLRs)和核苷酸結合寡聚結構域樣受體（NLRs)等; 3. 相關轉錄因子敲除小鼠， 比如，信號轉導和轉錄激活因子（STAT）和IFN調控因子（IRFs)等。
B. 轉基因/基因敲入病毒感染小鼠模型
人病毒多是通過與人細胞表面等相關受體結合，進入細胞內並藉助人細胞的幫助，才能開始複製增殖過程，從而導致人病毒感染性疾病的發生。因為物種間存在的差異，許多人病毒與小鼠細胞表面相應的受體很難直接結合，或者結合受體的親和力不高。因此，藉助基因編輯技術，將人細胞受體基因轉入小鼠體內，構建遺傳修飾人源化病毒感染小鼠模型，為在體內更好地開展人病毒致病性及抗病毒感染免疫反應機制等方面的研究，以及評價疫苗與藥物的安全性和有效性等臨床前相關研究提供了實際可行的工具。
4. 應用適應實驗進化方式獲得病毒變異強毒株
過去60多年來，應用適應實驗進化策略，已成為研究人病毒感染性疾病的主要方法。應用該方法成功構建的病毒感染致死性小鼠模型，無疑有助於深入揭示病毒致病機制，評價疫苗與新療法防治效果。
應用該方法建立病毒感染致死性小鼠模型，就是通過讓病毒經過小鼠體內一系列的傳代後，使其更加適應該宿主的先天與獲得免疫反應，病毒在不斷適應新宿主環境過程中，其本身遺傳物質也會發生相應變化，病毒的毒性也可能隨之而增強。所以，如同現實自然世界中病毒漫長的適應進化過程，病毒與宿主免疫反應之間的戰鬥是一直持續存在的，只不過這種所謂病毒小鼠適應實驗進化策略，是人為地按加速時間與組織特異性的可控方式進行的。
5. 建立協同雜交（CC）遺傳多樣性重組小鼠品系
近交系小鼠以及在此基礎上構建的遺傳修飾小鼠模型由於其遺傳背景一致性及結果可重複性等優點，成為研究病毒感染性疾病最為主要的實驗動物模型。然而，應用遺傳背景一致性小鼠也存在一定的局限性。不同於近交系小鼠，人群的遺傳背景是高度異質化的，所以，由近交系小鼠獲得的研究結果，無法真正揭示人群自然暴露於病毒所產生的表型多樣性的特徵。因此，如何增加小鼠品系的遺傳背景多樣性，以提高小鼠結果轉化的可靠性，解決病毒感染與複雜遺傳背景群體間相互作用問題，建立相應遺傳背景多樣性小鼠品系，比如協同雜交（Collaborative Cross-CC）小鼠品系，就具有一定的實際意義。
所謂CC小鼠品系，就是將一群不同遺傳背景的小鼠品系，進行相互交配繁殖重組，使其與人群遺傳多樣性更加相似，從而有助於研究群體中，哪些宿主基因多態性決定表型變化。目前，CC小鼠品系是通過8種小鼠品系互配獲得，其中包括5種經典實驗室品系，比如C57BL/6J、 129S1/SvImJ、A/J、NOD/ShiLtJ和NZO/HiLtJ；以及其他3種野生品系，比如WSB/EiJ、CAST/ EiJ、和PWK/PhJ。應用「漏鬥型育種」（funnel breeding ）的方式進行不斷的繁殖交配，最終繁育形成的CC小鼠品系分別具有八種原始品系小鼠獨一無二的基因組重組模式。目前已有超過60多種近交系CC小鼠品系可供研究者們使用(https:// csbio.unc.edu/CCstatus/index.py）。
目前提供的CC小鼠也為近交品系，因此，由這類小鼠產生的研究結果，同樣具有重複性與可比性的優勢。當然，考慮到CC小鼠是來自8種原始品系重組衍生而來的，也只是該8種小鼠遺傳背景的獨特組合，所以，來自CC小鼠研究的特殊表型結果，往往也不同於任何原始8種品系中單一小鼠品系的表型。利用CC小鼠表型多樣化的優勢，有助於建立病毒感染性疾病的完善模型。比如，對於Ebola病毒感染小鼠模型，雖然，應用小鼠適應Ebola病毒可以感染常規野生小鼠品系，研究疾病致病過程和驗證疫苗與治療效果，但是，這類感染小鼠模型無法完全反映該病毒感染人體所表現出的臨床疾病特徵。應用CC小鼠構建新型Ebola病毒感染性出血熱疾病小鼠模型，通過分析出現包括出血現象和肝損害等嚴重疾病症狀的CC小鼠品系表明，不同的CC小鼠表現出差異極大的易感性。
通過比較來自CC小鼠品系的表型結果，有利於揭示宿主遺傳背景變化對特定表型的影響，包括病毒感染引起的免疫應答反應，以及特定遺傳位點的特殊作用等。已有的研究結果表明，利用CC小鼠所具有的遺傳多樣性優勢，建立不同的新型小鼠模型，使病毒感染與疾病關係的研究更接近人群病毒感染疾病表型。並且，如果一旦建立了某個新型病毒感染疾病表型的CC小鼠，進一步識別與該新型病毒感染疾病表型結果相關的遺傳位點就成為可能，從而有助於充分揭示該病毒的致病機制。因此認為，CC小鼠是目前能更好反映人疾病某些特性，並應用於病毒感染性疾病研究的新型小鼠模型。
三、應用小鼠模型研究病毒感染性疾病的前景與展望？
應用遺傳背景明確的近交系小鼠、細胞/組織移植的人源化小鼠、以及基因編輯小鼠等模型不僅有助於研究病毒致病機制、闡明特異性基因在感染性疾病發展中作用，也為針對不同病毒感染疾病預防與治療的潛在靶點的尋找，提供了有效且方便可行的體內研究實驗動物。
我們需要明白的是，沒有哪種實驗動物模型能完全複製人病毒感染的真實反應過程，只能選擇較為合適的動物模型，這需要考慮多方面的綜合因素，比如，是否對該病毒敏感、與人體生理學方面的保守性、重複性、簡便可行的操作、安全與成本等方面。
理想的人病毒感染疾病動物模型， 應該是能真實反映人病毒感染性疾病的臨床症狀和致病過程。當然，最佳動物模型還應該符合其他要求，比如，動物對人病毒易感，有與人病毒感染性疾病相似的感染途徑。另外，按FDA的「動物有效規則」，出於安全與倫理考慮，無法直接在人群進行疫苗與治療方面等的實驗研究。因此，人群研究必須是在通過了應用相應動物模型的臨床前實驗研究之後，才能獲得批准的。病毒學的許多研究領域，都需要應用符合要求的標準化動物模型來評價疫苗與治療方法的安全性與有效性。比如，基因敲除小鼠、轉基因小鼠、人源化小鼠等。
病毒易變異的特性，增加了建立理想的動物模型的難度。所以，為了能更加準確反映病毒自然感染變化特徵，建立所謂理想動物模型的策略與方法也需要隨之而發展。
在研究人病毒感染性疾病特徵及其免疫反應機制等方面，應用細胞/組織移植方法建立的人源化小鼠模型已成為極其重要的研究工具。當然，該類人源化小鼠模型也存在一定的局限，比如：1. 在構建過程中，小鼠與小鼠種系之間常常出現差異變化，增加了準確解釋結果的難度；2. 該方法構建的小鼠-人嵌合模型中，相關分子和細胞在小鼠體內發育與形成並非是完整的，導致某些細胞間的相互作用難以順利進行；3. 在這種人源化小鼠中，調控病毒致病過程的機制也可能與真實情況有所不同。比如，B細胞的成熟、抗體產生和凝血反應等表現出不同的調控機制；4. 與其他小鼠模型相比，則有構建成本較高，動物操作與相關供應方面限制等不足。
因此，應用基因編輯技術構建人源化小鼠模型就顯示其獨特的優勢。在傳統原核注射轉基因和ES打靶技術基礎上，CRISPR-Cas9基因編輯創新技術的出現，結合Cre/lox系統的應用，使對相關基因進行時間與空間上特異性的修飾成為可能，從而極大促進了小鼠模型在研究病毒感染性疾病中的應用。小鼠基因組學及其完整的遺傳信息方面研究的不斷發展，為研發新型小鼠模型創造了條件。
小鼠模型已經是，並且將繼續是研究病毒感染性疾病致病機制，以及評價疫苗和抗病毒療法的重要資源。雖然，小鼠模型並不適合某些病毒引起的相關疾病，比如某些人病毒只感染人或黑猩猩 ，但藉助基因編輯技術與人源化小鼠模型，則可能有助於此類病毒感染性疾病小鼠模型的建立。並且遺傳背景多樣性的CC小鼠品系的獲得，也使研究宿主遺傳多樣性對感染反應性的影響成為可能。利用CC小鼠品系的表型多樣性的特點，也將有助於構建相應的能更好反映人病毒感染性疾病特性的實驗模型體系。