多肽合成中的茚三酮檢測(The Kaiser Test)

2021-02-13 藥事縱橫
在多肽固相合成中，我們可以通過一些檢測手段定性檢測樹脂上是否存在游離氨基從而去簡單地判斷胺基酸是否偶聯完全。下面介紹一種常用的檢測方法。

試劑1：5 g 茚三酮 溶解到100ml乙醇中

試劑2：80 g 苯酚 溶解到20ml乙醇中

試劑3：2 ml 0.001 M KCN 加入到 98 ml 重蒸吡啶中


關於試劑的配製有幾點注意事項：

茚三酮和苯酚不是太好溶，尤其是苯酚，溶解時應注意。氰化鉀在顯色反應中起到催化作用，如有劇毒試劑氰化鉀不好搞到的話可以不加。重蒸吡啶時最好在吡啶中加入一定量的茚三酮，在重蒸過程中可以除去吡啶中使茚三酮變色的物質。

配置好的茚三酮溶液應避光保存。

取少量樹脂於小玻璃管或小子彈頭中，用DCM或者乙醇多次洗滌樹脂，過濾除去洗滌液，加入上述每種試劑2-5滴，混勻。100℃下加熱5分鐘。觀察顯色結果。

關於檢測操作的注意事項：

樹脂不要取太多，KT檢測很靈敏，取太多的話會影響檢測結果。用DCM洗滌的話洗滌液一定要濾乾淨，否則加熱過程中樹脂會噴出。加熱時間應該控制好，時間過短可能會造成假陽性（游離氨基還未反應顯色）。加熱時間過長胺基酸的Fmoc保護基和賴氨酸的Boc側鏈保護基會掉，出現假陰性結果。

KT檢測是針對游離氨基的一種靈敏的檢測方法，當有游離氨基存在時，檢測結果為藍色。如在固相合成中脫除Fmoc保護基後檢測樹脂，會觀察到不透明的深藍色。特殊的胺基酸殘基會顯示出別的顏色，如脯氨酸，其仲氨基顯紅色。Asp, Asn, Cys, Ser, 和Thr會顯示出紅棕色（比脯氨酸顏色深，容易觀察）。當沒有游離氨基存在時，檢測結果顯黃色或無色，如固相合成是胺基酸偶聯完全，沒有游離氨基，次時檢測顯示出黃色或無色。所以可以用這種方法定性判斷偶聯反應終點。

脯氨酸

試劑配製

對於特殊的脯氨酸，可以使用四氯苯醌檢測，試劑配製方法如下

試劑1：2ml乙醛加入到98ml DMF中

試劑2：2g四氯苯醌加入到98ml DMF中

操作步驟

 取少量樹脂用DCM或者乙醇洗滌，滴入上述試劑各兩滴，混合均勻，室溫靜置5min，若存在游離氨基，樹脂顯藍色。

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責任編輯：文竹

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