從首針國產2價HPV疫苗注射看疫苗質量控制

　　回顧HPV疫苗研發和使用

　　2020.5.18 湖北武漢10歲女孩「可可」首例國產「2價」HPV疫苗接種；

　　2020.4.21 廈門萬泰滄海HPV疫苗(馨可寧，Cecolin)獲得CFDA的生物製品批籤發證明；

　　2019.12.31 國家藥監局批准首個重組HPV疫苗(馨可寧)上市；

　　2019.4–7 香港「水貨」MSD九價疫苗事件；

　　2018.4.20 MSD公司佳達修^®9(Gardasil^®9)在CFDA藥品審評中心申請獲批；

　　2018.4.10 廣東深圳將HPV疫苗納入醫保支付(二價和四價疫苗)；

　　2017.7.31 山東德州20歲女孩中國內地首例HPV疫苗接種；

　　2017.7 GSK公司Cervarix^®(希瑞適)批准在國內上市；

　　2016.3.30 我國HPV融合蛋白疫苗即將進入臨床試驗階段；

　　2014.12 美國食藥局(FDA)批准MSD 9價HPV(Gardasil^®9)疫苗上市；

　　2011 廈門萬泰公司HPV疫苗進入臨床實驗階段；

　　2006.8.28 澳大利亞昆士蘭一對姐妹世界首例HPV疫苗接種；

　　2002 中國首個宮頸癌疫苗研製項目啟動；廈門大學、廈門萬泰滄海生物技術有限公司、北京萬泰生物藥業股份有限公司聯合研製。

　　宮頸癌與HPV疫苗問世

　　宮頸癌在女性中的發病率僅次於乳腺癌，其中由人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致佔大多數。迄今，已分離出HPV亞型達100多種，其中至少14種亞型有致病性。而根據統計，大多數的宮頸癌可以檢測出中可測出高危型HPV16和18亞型，其中HPV16感染佔所有宮頸癌發生的70%。低危型HPV6和11亞型與尖銳溼疣和復發性呼吸道乳頭狀瘤關係密切。

　　2006年，世界上第一支HPV疫苗上市。該疫苗是MSD公司生產的佳達修^®4價HPV疫苗，覆蓋了最危險的16型以及6型、11型和18型。後來，GSK研發上市了希瑞適^®2價HPV疫苗。「2價苗」的推薦注射年齡最廣，可用於9–45歲的女性。2014年，MSD公司上市了佳達修^®9九價HPV疫苗，該產品可以預防90%以上的宮頸癌和其他由HPV引起的相關疾病。再加上我國廈門萬泰研發的馨可寧^®2價HPV疫苗，目前一共有4款疫苗可供使用。

　　值得一提的是，我國生產的「2價苗」對9–15歲女性只需免疫2針，價格是329元/支。且根據臨床實驗研究結果，國產疫苗與進口疫苗對HPV病毒的抵抗能力相近。對於這16、18兩個亞型來說，9價苗的效果與2價苗相近。

疫苗與注射劑質量控制和儀器

　　HPV疫苗按照作用分為預防性疫苗和治療性疫苗。預防性疫苗主要通過誘導機體內B細胞介導的體液免疫產生中和抗體抵抗HPV感染；治療性疫苗主要通過T細胞介導的細胞免疫清除病毒感染或已變異的細胞。已經上市的MSD、GSK和萬泰公司的4個品種都屬於預防性疫苗。HPV融合蛋白疫苗屬於治療性疫苗，2016年開始在臨床研究中。

(圖為GSK二價HPV疫苗希瑞適^®說明書截圖)

　　《中國藥典》通則(0102 注射劑)規定：「注射劑係指原料藥物或與適宜的輔料製成的供注入體內的無菌製劑。注射劑可分為注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液等。包括溶液型、乳狀液型或混懸型等注射液。可用於皮下注射、皮內注射、肌內注射、靜脈注射、靜脈滴注、鞘內注射、椎管內注射等。

HPV疫苗為肌肉注射的注射液，其中的質量控制環節以及使用的儀器如下：

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【裝量】重量除以相對密度計算裝量。由於疫苗或者注射劑的體積可能較小，可以採用精密稱供試品內容物的重量，除以供試品相對密度得出相應的裝量。相對密度可以使用2020版《中國藥典》四部(草案)通則裡面新提出的「振蕩型密度計法」進行測定。

　　(圖為METTLER超越系列密度計D6)

　　預裝式注射器和彈筒式裝置的供試品：標示裝量不大於2 mL者，取供試品5支(瓶)；2 mL以上至50 mL者，取供試品3支(瓶)。供試品與所配注射器、針頭或活塞裝配後將供試品緩慢連續注入容器(不排盡針頭中的液體)，按單劑量供試品要求進行裝量檢查，應不低於標示量。

【pH值】應該與體液相近，體液約為7.4，所以注射劑的pH應在4–9之間。可以使用pH計來測量。

　　(圖為雷磁PHSJ-6L型 pH計)

【滲透壓摩爾濃度】注射劑的滲透壓應與人體血液等滲。正常人體血液的滲透壓摩爾濃度範圍為285–310 mOsmol/kg，0.9%氯化鈉溶液或5%葡萄糖溶液的滲透壓摩爾濃度與人體血液相當。可採用滲透壓摩爾濃度測定儀利用冰點下降的原理設計的測量。

　　(圖為ADVANCED OsmoTECH 滲透壓儀)

【可見異物】(通則0904)在規定條件下應看不到不溶性物質(粒度或長度大於50 μm)。可見異物檢查法有燈檢法和光散射法。一般常用燈檢法，該方法不適用深色透明容器包裝或液體色澤較深(一般深於各標準比色液7號)的品種；光散射法不適合混懸型、乳狀液型注射液和滴眼液。可使用可見異物檢測儀。

　　混懸注射液粒徑質量要求：原料藥物粒徑應控制在15 μm以下，含15–20 μm(間有個別20–50 μm)者，不應超過10%，若有可見沉澱，振搖時應容易分散均勻。混懸型注射液不得用於靜脈注射或椎管內注射。

【不溶性微粒】(通則0903)本法系用以檢查靜脈用注射劑(溶液型注射液、注射用無菌粉末、注射用濃溶液)及供靜脈注射用無菌原料藥中不溶性微粒的大小及數量。本法包括光阻法和顯微計數法。當光阻法測定結果不符合規定或供試品不適於用光阻法測定時，應採用顯微計數法進行測定，並以顯微計數法的測定結果作為判定依據。

　　(圖為ProteinSimple MFI5100微流成像顆粒分析系統)

【無菌】照無菌檢查法(通則1101)檢查，應符合規定。無菌檢查法系用於檢查藥典要求無菌的藥品、生物製品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。無菌檢查應在無菌條件下進行，試驗環境必須達到無菌檢查的要求，檢驗全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物汙染，防止汙染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。可以使用四聯培養器或者微生物限度檢測儀。

　　(圖為廣東環凱MFS微生物限度檢測儀)

【細菌內毒素】(通則1143)本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。包括即凝膠法和光度測定法，後者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠限度試驗結果為準。

　　(圖為美國Endosafe細菌內毒素快速檢測系統)

【熱原】(通則1142)本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。實驗室中，可以使用純水機過濾除去熱原。

　　(圖為上海瑞楓超純水系統RephiLe Direct-Pure Genie「國產好儀器」)

【安全性】異常毒性、過敏反應、溶血與凝聚以及降壓物質等。

【重金屬及有害元素殘留量】總重金屬不得超過百萬分之十，砷鹽不得超過百萬分之二。除另有規定外，中藥注射劑照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321)測定，按各品種項下每日最大使用量計算，鉛不得超過12 μg，鎘不得超過3 μg，砷不得超過6 μg，汞不得超過2 μg，銅不得超過150 μg。可以使用ICP-AES進行分析。

疫苗生產與運輸的質量控制

　　疫苗生產過程控制的基本要求：全過程質量控制，批間一致性的控制，目標成分及非目標成分的控制。疫苗生產用種子批系統包括生產用菌毒種及基因工程疫苗生產用細胞株，應符合本版藥典的相關要求。

　　1. 生產用毒種種子批的檢定項目：【血清學、全病毒或部分特徵性序列測序】、【外源因子】、【病毒表型】、【遺傳穩定性】等。

　　種子庫保藏一般可採取液體超低溫冷藏或液氮等方式保藏，以保證其穩定性。種子庫檢定時應證明表達系統的遺傳穩定性、目的基因表達穩定性和生產穩定性等。主細胞庫需進行全面檢定，工作細胞庫重點檢測外源因子汙染。

　　2. 中間產物：中間產物是從起始材料開始，通過一個或多個不同工藝如發酵、培養、分離以及純化，添加必要的穩定劑等各工藝過程所獲得的產物。

　　【病毒滴度】、【活菌數】、【抗原活性】、【蛋白質含量】以及【比活性指標】的檢測，並需考慮對後續工藝階段無法檢測的項目，如【純度】、【殘留物】等進行檢測。

　　3. 半成品：應按照批准的配方將所有組分按配製均一混合製成半成品。半成品配製完成後，應儘快分裝，特別是鋁佐劑吸附的疫苗。（HPV疫苗屬於此類）

　　【無菌檢查】、【細菌內毒素檢查】、【殘留有機溶劑】、【防腐劑】等項目，鋁佐劑疫苗應進行【吸附率】和【鋁含量檢測】。

　　4. 成品(分裝)：是指通過分裝設備將半成品疫苗均一地分配至規定的終容器的過程。分裝持續的時間、分裝環境的溫度和溼度等進行控制。分裝設備應經驗證，以確保溫度控制系統和內容物分裝量均一性等裝置可靠。

　　【鑑別】、【理化測定】、【純度】、【效力】、【異常毒性檢查】、【無菌檢查】、【細菌內毒素檢查】、【佐劑】、【防腐劑及工藝雜質殘留物檢測】等。

　　工藝雜質主要包括以傳代細胞生產的病毒性疫苗中宿主細胞蛋白質和DNA殘留，以及生產過程中用於培養、滅活、提取和純化等工藝過程的化學、生物原材料殘留物，如牛血清、甲醛和β-丙內酯等滅活劑、抗生素殘留等，由於製品特性無法在成品中檢測的工藝雜質，應在適當的中間產物取樣檢測，其檢測結果應能準確反映每一成品劑量中的殘留水平。

　　5. 穩定性評價：疫苗穩定性評價包括實時條件下的研究，加速研究，極端條件研究，熱穩定性研究。根據疫苗運輸過程可能脫冷鏈及震動等情況，結合理化分析和生物學方法進行穩定性檢測。也可以根據疫苗的種類做主要參數的效力試驗。

理化分析：也可作為穩定性研究的一部分，如一般安全性、聚合物程度、pH、水分、防腐劑、容器以及密封程度，內包材的影響因素等等。

　　生物製品質量檢定原則：應儘可能採用理化分析方法或體外生物學方法取代動物試驗，以減少動物的使用。檢定用動物，除另有規定外，均應採用清潔級或清潔級以上的動物；小鼠至少應來自封閉群動物。

效力試驗：不同疫苗可採用不同形式進行該項檢測。(如減毒活疫苗採用感染性試驗、多糖蛋白結合疫苗可檢測結合的多糖含量等)。補充數據：抗原降解圖譜、結合疫苗的載體蛋白解離、佐劑與抗原複合物的解離等。

嚴格的疫苗管理法規

　　自從山東濟南非法經營二類疫苗、長春長生生物疫苗質量等事件以後，《藥品管理法》對於疫苗等生物製品的生產、銷售和使用進行了更加嚴格的管理。

如上圖HPV說明書。貯存過程應設定適宜的溫度，通常為2–8℃；應避免冰點溫度保存。除另有規定外，不得凍存，尤其是液體劑型的疫苗，特別是含鋁佐劑的疫苗。

　　2005年實施的《疫苗流通和預防接種管理條例》中明確規定，藥品零售企業不得從事疫苗的經營活動；2016年國務院修改了上述條例，藥品批發企業也不得從事疫苗的經營業務。對於國家規定的免費提供的「第一類疫苗」，實行採購單位與疫苗生產企業籤訂採購合同直接購買的方式。並且不得向其他單位或個人提供。

　　美國疫苗研究跳步?

　　目前，COVID-19疫情依然沒有得到完全控制。在沒有特效藥的情況下，疫苗注射就是做好隔離以外最有效的防控措施了。在這樣的情況下，美國一些製藥公司竟公然發布：「欲跳過動物實驗，直接進行人體臨床試驗。」動物實驗是疫苗研究的「金標準」，沒有臨床前研究就直接上臨床，安全性如何保證?再者說，從醫學倫理的角度而言，沒有代替實驗就直接進入人體的實驗，實驗志願者的安全是否可以得到保證?

（圖為小動物活體成像實驗研究）

　　回顧HPV疫苗在我國的研究歷程。從2002年廈門萬泰公司立項，到2020年馨可寧在武漢首劑注射，經過了整整18年！而不管進口HPV疫苗還是萬泰，在臨床實驗階段前就至少進行了10年的時間。可見，疫苗研究的艱辛和成本是難以想像的。美國人疫苗的研究也絕不能因為美國人自己防疫的疏忽而「跳步」。

　　如今，優質的國產二價HPV疫苗已經問世，宮頸癌的一級預防在中國可以得到很好的解決。而且疫苗的質量通過各種檢測儀器保障，可以確保安全。當然，也相信我國的科研團隊可以儘快研製出治療「新冠」的疫苗，讓我們遠離COVID-19。