基於其剪接和未剪接的信使 RNA 的比例，計算出一個稱為 RNA 速度的量，用以揭示基因表達的變化方式。
圖片來源：velocyto
2018年，Karolinska研究所和哈佛醫學院的研究人員在《自然》雜誌上報告了一種捕獲單個細胞動態過程的技術。截至目前，該文章的引用已經到達 377，可見其在揭示一些生物學問題層面還是非常受歡迎的。
圖片來源：Nature
那麼如何利用單細胞數據進行該分析呢？今天我們就來聊一下 10X genomic 數據的分析流程。
Cellranger 預處理10X genomic 數據
10X genomic 數據的預處理是用 cellranger 軟體完成的，完成這一步之後會得到一個包含所有分析結果的文件夾，而這個文件夾就是你要做 RNA velocity 的基礎。
velocyto 的安裝
velocyto 目前有兩種不同的實現方式：R 和 Python
鑑於 Python 的流程耗時較少，以下就以該平臺為準。
圖片來源：velocyto
Python 的介紹頁如下圖所示：
圖片來源：velocyto
接下來就是安裝 velocyto，需要注意的是，velocyto 的運行基於 3.6 或更高的 python 版本，然後就是安裝：
pip install velocyto
安裝成功之後，在終端輸入 velocyto，會出現以下界面：
圖片來源：velocyto
在正式分析之前，還有兩個準備工作需要完成：
1、基因注釋文件的下載，這個可以自己在 GENCODE 或 Ensembl 上下載，不過如果你用的是 cellranger 流程，那麼它本身的注釋文件中就包含，位置在： ~/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0/genes/genes.gtf。
2、 下載 「expressed repeats annotation」
圖片來源：velocyto
其實第二步的這個是比較坑的，我在這個上面耽誤了好長時間。首先轉到 UCSC 的界面，在這裡有幾點需要注意，以下我標註上了紅框：
圖片來源：UCSC
下載結束之後我就上傳到伺服器去做分析，代碼很簡單，只有一行：
velocyto run10x -m ~/mm10_rmsk.gtf ~/results/sample/ ~/reference/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0/genes/genes.gtf
但是屢屢報錯，錯誤信息如下：
圖片來源：操作截圖
百思不得其解，在 GitHub 上也把別人的建議都搞了一遍，還是無法解除 bug，在請教了幾個朋友之後，發現有個事情比較詭異，那就是我從 UCSC 上下載的文件只有幾十 M，而他們的卻都是 500 M 左右，我感覺是不是因為網絡原因，導致我下載的文件不完整呀。果然，我在github上也看到了有人提到過這一點：
圖片來源：Github
哎，又是網速（再次吐槽重點室的網速哈~），反覆下載之後，得到了一個 500 M 的文件，本以為這樣就可以愉快地分析了，結果仍然報錯：
圖片來源：操作截圖
查看資料之後，發現這個報錯要麼是自己 samtools 的版本太低，要麼就是分配的內存不夠。看了看 run10x 這個命令下有這樣一個參數 「--samtools-memory」，可以設置 sort bam 文件時可佔用的內存。
圖片來源：velocyto
幾經周折之後，終於看到了以下界面：
圖片來源：操作截圖
我最終用到的命令是：
velocyto run10x -m ~/mm10_rmsk.gtf ~/results/sample/ ~/reference/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0/genes/genes.gtf --samtools-memory 8000 -@ 20
運行成功之後，會在 cellranger 結果文件夾中多了一個以 velocyto 命名的文件夾，其中包含的是 loom 格式的結果文件。
圖片來源：操作截圖
以上就是 velocyto 分析的第一步：產生 loom 格式的文件，這也是後續深入分析的基礎。在上述分析的過程中，看似簡單，但是也遇到了一些坑，希望自己遇到的這些坑能夠幫助到大家，也能夠節約大家的時間。
未完待續~