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為什麼要用多重（Multiplex IHC，mIHC）而非單染色IHC？如何優化mIHC實驗？
mIHC 實驗步驟
【筆記整理】
-為什麼使用多重而非單染色IHC？
如果您的研究方向是探索不同細胞類型之間的交互作用，或者需要評價多個生物標誌物和組織的表達或共定位，可以使用mIHC實驗。
-mIHC的基本原理
mIHC實驗是基於使用酪胺-螢光基團檢測開發的。其實驗步驟使用序列標記策略，每輪標記包含一抗孵育和二抗孵育。隨後是酪胺-螢光基團偶聯物沉澱。接下來將抗體剝離，或在微波爐中加熱，去除樣本中的抗體，所有沉澱的螢光基團，仍與樣本共價結合。
-mIHC實驗的抗體使用
使用經過高度驗證的抗體，確保得到可靠的結果。通常而言經過IHC-P驗證的抗體，同樣也能在mIHC中使用，但需要再進行實驗步驟優化。
-設置檢測組時應考慮的優化實驗的五個關鍵步驟
1. 基於酪胺的檢測與顯色檢測的最佳稀釋比例可能有所不同。在酪胺檢測的前提下，任何時候向多重實驗增加一個變量（抗體）時，對每種一抗進行滴定，確定實現最佳信號強度和信噪比的稀釋比例。
2. 進行螢光基團配對獲得一組均衡的信號。步驟：先使用檢測組中亮度最高的螢光基團，與低表達靶標抗體配對；而使用較弱的螢光基團與高豐度靶標的抗體配對。
3. 優化檢測組中每種一抗的使用順序，可以優化染色強度。原理是：評估多次加熱對每個表位和所取得的染色結果造成的影響，調整抗體標記時點的順序，最終使染色能夠準確表現所有靶標的表達情況。
4. 進行剝離檢測，確認是否已有效去除一抗和二抗。如果剝離不完全，可能出現同時檢測出多個螢光基團，使得這一輪和上一輪的靶標在實驗結束時產生誤導性結果。
5. 對每種抗體的單染色和多重染色進行平行比較。如果與單染色相比，多重染色中信號顯著降低或陽性染色細胞數量增加或減少，可能意味著您的實驗步驟還需要進一步優化。所以這一步是質量控制步驟。